Бактериологическая диагностика и морфологическая характеристика тканей и органов перепелов при экспериментальном эшерихиозе

На правах рукописи

МАНСУРОВА ЕКАТЕРИНА АНАТОЛЬЕВНА

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА

И МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ ПЕРЕПЕЛОВ

ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ЭШЕРИХИОЗЕ

06.02.02 – Ветеринарная микробиология, вирусология,

эпизоотология, микология с микотоксикологией

и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата ветеринарных наук

МОСКВА 2013

Работа выполнена на кафедре «Инфекционные и паразитарные болезни» ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств» (ФГБОУ ВПО «МГУПП») Министерства образования и науки РФ

Научный руководитель:	Ленченко Екатерина Михайловна, доктор ветеринарных наук, профессор
Официальные оппоненты:	Скородумов Дмитрий Иванович, доктор ветеринарных наук, профессор ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств» зав. кафедрой «Микробиология, вирусология, генная инженерия» Селезнев Сергей Борисович, доктор ветеринарных наук, профессор ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» проф. кафедры«Клиническая ветеринария»
Ведущая организация:	Государственное научное учреждение «Научно-исследовательский институт птицеперерабатывающей промышленности» Россельхозакадемии РФ (ГНУ «ВНИИПП»)

Защита состоится «27»июня2013 г. в «12.00» часов на заседании диссертационного советаД 212.148.09 при ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств» (109316, Москва, ул. Талалихина, 33).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств».

Автореферат разослан 2013 г.

Автореферат размещен на официальном сайте

Министерства образования и науки РФhttp://vak.ed.ru/ 2013г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор ветеринарных наук, профессор Андрианова Т.Г.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.В структуре инфекционной патологии птиц в 2012 г из числа заразных болезней удельный вес эшерихиоза составил 53,9 %, среди павших птиц – 92,0 % (Бобылева Г.А., 2013). Эшерихиоз птиц протекает в виде септицемии (Colicepticaemiaavium), сальпингита и колигранулематоза(Бессарабов Б.Ф., 1980, 2007; Тугаринов О.А., 1983; Стрельников А.П., 1987; Пирожков М.К., 1989; Радчук Н.А., 1990; Жаров А.В., 1995; Кунаков А.А., 1995; Сидоров М.А. и соавт., 1995; Селезнев С.Б., 2000; Куриленко А.Н. и соавт., 2005; Борисенкова А.Н. и соавт., 2004; Светоч Э.А., 2004; Крупальник В.Л., 2005; Хатько Н.Ф., 2005; Сидорчук А.А., 2007;Кожемяка Н. В., 2008; Кононенко А.Б. и соавт., 2009; Ленченко Е.М. и соавт., 2013; SamelsonL.E., 1985; StanleyV.G. etal., 1996;Collins, 2001; JaniceY.C., 2011).При идентификации из-за узкого спектра и невысокой чувствительности существующих наборов «О-коли сывороток»не типируется 49,0–54,3 % культур микроорганизмов E.coli. Схему бактериологи­ческой диагностики эшерихиоза завершает биологическая проба, характеризующаяся сложностью воспроизведения, чрезвычайной продолжительностью по времени исполнения. Восприимчивость лабораторных моделей зависит от вирулентности возбудителя, дозы, метода введения, чувствительности к термолабильным и термостабильным токсинам(Каврук Л.С., 1994; Светоч Э.А., 2000; Капустин А.В., 2001; Скородумов Д.И. и соавт., 2005; Рождественская Т.Н., 2011).При доместикации в неестественной среде обитания ограниченное территориальное пространство, нетрадиционное кормление являются основными причинами развития патологических процессов диких, экзотических и декоративных птиц (Бессарабов Б.Ф., 2005; Ежков В.О., 2008; Пименов Н.В., 2012). В частности, на перепелиных фермах технологии содержания птицы существенно отличаются от природных условий, что приводит к снижению уровня показателей естественной резистентности организма птицы (Паникар И.А. и соавт., 1992; Гущин В.В., 2003; Шваб А.А., 2006; Белогуров А.Н., 2009).Циркулирующие в перепелиных хозяйствах штаммы микроорганизмов E. coli были представлены серогруппами: 078, 0111, из числа выделенных 61,53 % имели адгезивные антигены: К88ав, К88ас, К99, 987Р, и F41, летальность перепелов при эшерихиозе составляла97,25 %, сальмонеллезе –

78,7% (Паникар И.А. и соавт., 1995; Булгакова И.А., 1997; ПанасенкоА.С., 2008). При заражении Micobacteriumaviumу перепелов развивалисьизменения, характерные для туберкулеза (Бушмелева П. В., 2011). При желудочно-кишечных болезнях в микробиоценозах кишечника перепелов увеличивалось содержание патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, в том числе E.coli (Шмидт Г.О., Плешакова В.И., 2012). Учитывая, что степень реализации потенциальной патогенности микроорганизмов определяется восприимчивостьюмакроорганизма, актуальность представляют исследования по воспроизведению инфекционного процесса на восприимчивых лабораторных моделях для изучения динамики патологических процессов, апробация и подбор эффективных диагностических сред, тест-систем для индикации и дифференциации микроорганизмов Escherichia coli.

Цель работы – изучить клинические признаки, особенности течения болезни, морфологические изменения, колонизационную резистентность кишечника, диссеминацию бактерий в ткани и органы перепелов при экспериментальном эшерихиозе.

Задачи исследований:

- изучить клинические признаки, особенности течения болезни, гематологические, биохимические показатели сыворотки крови перепелов при экспериментальном эшерихиозе;

- изучить динамику морфологических изменений тканей и органов перепелов при экспериментальном эшерихиозе;

- определить колонизационную резистентность кишечника и диссеминацию бактерий в ткани и органы перепелов при экспериментальном эшерихиозе;

- изучить гемолитические свойства, чувствительность к желчи и антибиотикам микроорганизмов Escherichiacoli, выделенных из патматериала перепелов;

- апробировать и оценить эффективность лабораторных моделей и тест-системы «VET-RPLA»для оценки патогенных свойств Escherichia coli, выделенных из патматериала перепелов.

Научная новизна.При экспериментальном воспроизведении эшерихиоза на перепелах установлено, что динамика патологических процессов при остром течении болезни обусловлена септицемией, при подостром течении – энтеротоксемией. Признаки воспалительного процесса, сопровождающегося миграцией и интерстициальной инфильтрацией псевдоэозинофилов, развиваются через 4-6 ч, моноцитов – через 7-8 ч после заражения микроорганизмами E. coli. Количество энтеробактерий (КОЕ lg/г)слепых отростков кишечника перепелов при экспериментальном эшерихиозе составляет 4,19±0,15 – 6,88±0,21, индекс колонизации (ИК) эшерихий у 10-ти суточных перепелов – 0,766; 20-ти суточных – 0,797; 30-ти суточных – 0,837. При изучении чувствительности микроорганизмов к действию желчи перепелов установлено, что зоны задержки роста микроорганизмов E. coli составляют 11,9-17,6 мм.При оценке токсигенных свойств культур микроорганизмов Escherichiacoli, выделенных из патматериала перепелов, с применением тест-системы «VET-RPLA», основанной на методе обратной латекс-агглютинации, установлена корреляция результатов исследования с результатами, основанными на применении лабораторных моделей (r=0,89).

Практическая значимость работы.Установлена эффективность применения хромогенных сред «ChromogenicE.coli/Coliformmediumagar», «LMX Manafi&Osmer», позволяющих в течение 24ч при идентификации микроорганизмов дифференцировать эшерихии от таксономически сходных видов энтеробактерий, выделенных из патматериала перепелов.Для количественного учета микроорганизмов в пищевых продуктах, микробиоценозах кишечника птицы, разработан способ определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, позволяющий сократить расход питательных сред, стерильной бактериологической посуды. Результаты исследований используются в учебном процессе на ветеринарно-санитарном факультете ФГБОУ ВПО «МГУПП» по дисциплинам: «Цитология, гистология, эмбриология»; «Эпизоотология».

Апробация материалов диссертации. Основные результаты диссертационной работы доложены и одобрены на заседаниях кафедры «Инфекционные и паразитарные болезни» ФГБОУ ВПО «МГУПП» (Москва, 2008-2011 гг.); на VI, VII, VIII Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (М., 2009; М., 2010; М., 2011).

Основные положения, выносимые на защиту:

• результаты клинико-морфологических исследований, оценки колонизационной резистентности кишечника перепелов и диссеминации бактерий в ткани и органы перепелов при экспериментальном эшерихиозе;
• результаты изучения гемолитических свойств, чувствительности к желчи и антибиотикам микроорганизмовEscherichiacoli, выделенных из патматериала перепелов;
• эффективность лабораторных моделей и тест-системы «VET-RPLA»для оценки патогенных свойств Escherichiacoli, выделенных из патматериала перепелов.

Публикация результатов исследований. По материалам диссертационной работы опубликовано 6 научных работ, в т.ч. 3 – в журналах, рекомендованных ВАК.

Структураи объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, выводов, библиографии, приложения. Работа изложена на 110 страницах компьютерного текста, содержит 15 таблиц, 20 фотографий и микрофотографий. Библиографический список включает 124 источников, из них 77 иностранных авторов.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена с2007 по 2012 гг. на кафедре «Инфекционные и паразитарные болезни» ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств» в соответствии с планом НИР (тема № 7-7-07). Экспериментальные исследования проводили на перепелах 10-, 20-, 30-ти суточного возраста постинкубационного онтогенеза породы Coturnixcoturnixjaponica, выращиваемые в птицеводческом хозяйстве OOO «Инкубаторий», Чеховского района, Московской области. В опытах использовали штаммы микроорганизмов: Escherichiacoli О2, № 388;Escherichiacoli О78:К80, № 320;EscherichiacoliО115 №723; Escherichiacoli О138:К81, № 723;Salmonellaenteritidis№ 204;Salmonellatyphimurium № 5715; Proteusvulgaris Н2091; Klebsiellapneumonia №24; Staphylococcusaureus№ 123, полученные из коллекции ФГБУ «ВГНКИ». Бактериологические исследования проводили в соответствии с «Методическими указаниями по бактериологической диагностикеколибактериоза (эшерихиоза) животных» (2000); «Инструкцией по санитарно-микробиологическому контролю тушек, мяса птицы, птицепродуктов, яиц и яйцепродуктов на птицеводческих и птицеперерабатывающих предприятиях» (М., 1990).Идентификацию микроорганизмов проводили, изучая морфологические, тинкториальные, культуральные, ферментативные свойства микроорганизмов (Герхардт Ф. и соавт., 1984; Сидоров М.А. и соавт., 1995; Скородумов Д.И. и соавт., 2005). Биохимические свойства микроорганизмов изучали с использованием сред Гисса итест-систем: «СИБ» (НПО «Диагностические системы», г. Нижний Новгород); «Enterotube II» («BectonDickinsonGmbHBDDiagnostics»). Серогрупповую принадлежность Е.сoliопределяли в реакции агглютинации с диагностическими О-коли агглютинирующими сыворотками, ФГУП «Армавирская биофабрика».Гемолитическую активность микроорганизмов оценивали на МПА с содержанием 5,0 % стерильной крови барана (Лабинская А.С., 1984).Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам и желчи перепелов изучали методом диффузии в агар (Навашин С.М., Фомина И.П., 1982).Индекс колонизации (ИК) эшерихий рассчитывали по формуле: ИК=А/В, где А – % эшерихий, выделенных из кишечника незараженных птиц; В– % эшерихий, выделенных из кишечника зараженных птиц (Скородумов Д.И. и соавт., 2008).Патогенные свойства микроорганизмов оценивали с применением лабораторных моделей: эмбрионов кур породы "Белый леггорн"; перепелов породы Coturnix coturnix japonica; беспородных лабораторных мышей, массой 14-16 г. Токсигенные свойства микроорганизмов изучали на лабораторных моделях (белые беспородные мыши; морские свинки породы «Self»(Биргер М.О., 1973).Для оценки способности Е.coli к продукции токсинов применяли тест-систему «VET-RPLA»(OXOID). Для определения бактерицидной, лизоцимной активностисыворотки крови, активности фагоцитоза, фагоцитарного индекса использовали общепринятые методы. Гематологические и биохимические показатели сыворотки крови перепелов исследовали на гематологическом ветеринарном анализаторе автомате «PCE-90 Vet» и полуавтоматическом биохимическом анализаторе «ClimaPlus» (RAL, Испания). Патологоанатомические исследования проводили общепринятыми методами (Автандилов Г.Г., 1972; Бессарабов Б.Ф., 1980; Жаров А.В., 1981; Стрельников А.П., 1985, 2007; Селезнев С.Б., 2000; Сулейманов С.М., 2002).Для гистологических исследований исследуемый материал фиксировали 10,0 % формалином и заключали в парафин, срезы окрашивали гематоксилином и эозином; по Ван Гизону; по Крантцу (Волкова О.В., Елецкий Ю.К., 1971).При оптической микроскопии для получения репрезентативной информации исследования проводили методом случайного отбора поля зрения микроскопа «H604 TTrinocularUnico» (USA).Экспериментальные данные подвергали статистической обработке общепринятым методом (Ашмарин И.П., Воробьев Л.А., 1962; Садовский Н.В., 1975), с использованием программы «Statistika» для PCMicrosoftExcel 2007.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3. 1. Клинические признаки, особенности течения болезни,

гематологические и биохимические показатели перепелов

при экспериментальном эшерихиозе

Для экспериментального воспроизведения эшерихиоза использовали особи перепелов породы Coturnixcoturnixjaponica (n=45) 10-, 20-, 30-ти суточного постинкубационного онтогенеза, птицу по принципу аналогов (одинаковый возраст, пол, живая масса, условия кормления и содержания) разделили на группы: контроль -интраназальное введение 0,5 см3 0,9 % раствора NaCl(n=15); опыт -интраназальное заражение E.coliО2, № 388(n=15) и E. coli О78:К80, № 320(n=15) в дозе 0,5 см3 в концентрации 1 млрд./ см3.При заражении перепелов культурами микроорганизмов E. coli О2 и E. coli О78:К80 клинические признаки болезни были сходными, наблюдались через24-48ч после заражения в виде про­грессирующей депрессии, отсутствия аппетита, жажды, цианоза слизи­стых оболочек, в последующие 4-5 суток развивались признаки диареи.Наблюдение за птицей (продолжительность эксперимента 25 суток) позволили выявить острое и подострое течение болезни (табл. 1).

Таблица 1

Результаты экспериментального заражения перепелов

Группа	Течение болезни				Заболеваемость		Летальность
птиц	Острое		Подострое
(n=30)	Абс.	%	Абс.	%	Абс.	%	Абс.	%
	Escherichia coliО2
10-ти сут.	4	80	1	20	5	100	5	100
20-ти сут.	3	60	2	40	5	100	3	60
30-ти сут.	1	20	4	80	5	100	2	40
	Escherichia coliО78:К80
10-ти сут.	4	80	1	20	5	100	4	80
20-ти сут.	2	40	3	60	5	100	4	80
30-ти сут.	2	40	3	60	5	100	2	40