Совершенствование бактериологической диагностики туберкулеза животных в условиях изменяющейся эпизоотической ситуации

На правах рукописи

КУРАНДО ЕКАТЕРИНА ЭДУАРДОВНА

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА ЖИВОТНЫХ В УСЛОВИЯХ ИЗМЕНЯЮЩЕЙСЯ ЭПИЗООТИЧЕСКОЙ СИТУАЦИИ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология,

микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2010

Работа выполнена в лаборатории микобактериозов Государственного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко» Россельхозакадемии (ГНУ «ВИЭВ»).

Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент

Букова Наталия Константиновна

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Шумилов Константин Васильевич,

Заслуженный деятель науки РФ

доктор ветеринарных наук, профессор

Масимов Нусрат Абулфатович

Ведущая организация: ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных» СО Россельхозакадемии

Защита диссертации состоится «____» _________2010г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 220.011.01 в Федеральном государственном учреждении «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») по адресу: Россия, 123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, д. 5, телефон/ факс (495) 253-14-91.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «ВГНКИ».

Автореферат разослан «___» _________2010г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат ветеринарных наук, доцент,

Заслуженный ветеринарный врач РФ Козырев Ю.А.

1. Общая характеристика работы.

1.1. Актуальность темы. В ХХI веке туберкулез продолжает оставаться одной из наиболее сложных проблем инфекционной патологии. В системе профилактических и оздоровительных мероприятий основополагающее место занимает комплекс диагностических методов, включающий клиническое, аллергическое, патологоанатомическое и бактериологическое исследования животных.

Проведенные в ХХ веке противоэпизоотические мероприятия привели к сокращению распространенности туберкулеза на значительной территории Российской Федерации, уменьшению количества больных животных с поздними и генерализованными формами туберкулеза, но, в то же время, увеличению поголовья скота с проявлением микобактериозов. Изменилась роль каждого метода исследования животных на туберкулез. В 30-40 годах подвергали убою животных, клинически больных и с открытыми формами туберкулеза легких, вымени, кишечника и матки, которые диагностировались, в основном, бактериоскопическим исследованием. С 1932г. в основу противотуберкулезных мероприятий был положен метод Банга, а в 1940г. в качестве основного метода диагностики туберкулеза было введено аллергическое исследование животных. Результаты туберкулиновой пробы являлись решающими при определении состояния по туберкулезу животных и хозяйств, где на фоне широкой распространенности болезни ошибки были редки.

На рубеже 50-60 годов возникла и стала широко распространяться ситуация, когда у реагировавших на туберкулин животных диагноз на туберкулез не подтверждался бактериологическим исследованием. При этом выделяли различные виды нетуберкулезных микобактерий, роль которых была недостаточно изучена в патологии человека и животных. Таким образом, появилась проблема микобактериозов и необходимость определения эпизоотического статуса поголовья скота. С этого времени показания туберкулиновой пробы стали ориентировочными, а эпизоотический статус хозяйств определяют по результатам бактериологического исследования, так как от выделенных видов микобактерий зависит уровень проведения профилактических и оздоровительных мероприятий.

Выделение культур микобактерий из биологического материала во многом зависит от вида питательной среды. Несмотря на большое разнообразие питательных сред, применяемых при культуральном исследовании, срок выделения возбудителя туберкулеза колеблется практически в одинаковых пределах. Кроме того, не всегда удается со 100% эффективностью выявить возбудителя туберкулеза из патологического материала больных животных, тем более обнаружить микобактерии с ослабленной жизнеспособностью или ферментативной активностью, или присутствующие в исследуемом материале в небольшом количестве (В.В. Власенко, 1998). Стало актуальным внедрение в лабораторную практику новых питательных сред, которые позволяли бы сократить сроки выделения культур микобактерий (В.И. Белоусов и соавт., 2004).

В.В. Власенко и П.И. Багрий (2001) разработали оригинальную питательную среду ВКГ, позволяющую выявить микобактерии в исследуемом материале в течение 2-4 суток. Испытание этой среды, которая позволила бы ускорить выделение возбудителя туберкулеза и нетуберкулезных микобактерий из биологического материала, представляется весьма актуальным.

В последнее время в практику лабораторной диагностики туберкулеза внедряются молекулярно-генетические и иммунологические методы, обладающие высокой чувствительностью и специфичностью, позволяющие обнаружить микобактерии в образцах биоматериала в короткие сроки (И.Г. Шемякин и соавт., 2000). Однако эти методы еще недостаточно используются в ветеринарной практике.

В современных условиях, при изменяющейся эпизоотической ситуации, актуальным является ревизионная оценка применяемых методов исследования животных на туберкулез и усовершенствование комплекса бактериологической диагностики болезни.

1.2 Цель и задачи исследований. Усовершенствование комплекса диагностических тестов при бактериологическом исследовании на туберкулез животных в современных условиях проявления эпизоотического процесса инфекции.

Задачи исследований:

- охарактеризовать изменения эпизоотической обстановки по туберкулезу крупного рогатого скота в Российской Федерации за 1961-2008гг.;

- провести анализ результатов бактериологических исследований на туберкулез животных в субъектах Российской Федерации за 1978-2008гг.;

- создать компьютерный банк данных бактериологических исследований, отражающих изменения показателей распространенности туберкулеза и микобактериозов крупного рогатого скота в субъектах Российской Федерации в 1978-2008гг.;

- изучить культуральные, морфологические, биохимические и биологические свойства микобактерий, выделенных из биоматериала зоопарковых животных;

- изучить чувствительность питательных сред ВКГ, Левенштейна-Йенсена, ФАСТ-3Л к росту референтных туберкулезных и нетуберкулезных микобактерий;

- изучить эффективность питательной среды ВКГ со стимулятором роста для выделения возбудителя туберкулеза бычьего вида из биоматериала крупного рогатого скота;

- изучить биологические свойства микобактерий, выращенных на среде ВКГ, на морских свинках и кроликах;

- усовершенствовать схему бактериологических исследований на туберкулез животных.

1.3. Научная новизна. Впервые охарактеризованы динамика и закономерности проявления эпизоотического процесса туберкулеза крупного рогатого скота и птицы в Российской Федерации, проведен ретроспективный анализ результатов бактериологической диагностики туберкулеза животных в РФ за 1961-2008гг. Создан компьютерный банк данных бактериологических исследований, отражающих изменения показателей распространенности туберкулеза и микобактериозов крупного рогатого скота в субъектах Российской Федерации в 1978-2008гг. Определен видовой состав микобактерий, выделяемых в различных регионах Российской Федерации.

Изучены культуральные, морфологические, биохимические и биологические свойства микобактерий, выделенных из биоматериала зоопарковых животных. Изучены свойства питательной среды ВКГ со стимулятором роста для ускоренного выделения микобактерий из биоматериала животных. Усовершенствована схема бактериологического исследования на туберкулез и микобактериозы животных.

1.4. Практическая значимость работы. Результаты исследования по определению видового спектра микобактерий, выделенных от крупного рогатого скота и объектов внешней среды, создают основу дифференцированного проведения профилактических и оздоровительных мероприятий при микобактериальных инфекциях. Усовершенствованная схема исследований биоматериала от животных повышает качество бактериологических исследований и может быть использована в бактериологических и научных лабораториях.

О практической значимости результатов исследований также свидетельствуют разработанные автором (в соавторстве) «Методические рекомендации по диагностике микобактериальных инфекций животных» и «Методические рекомендации по идентификации M. avium subsp. paratuberculosis и других микобактерий комплекса avium-intracellulare», утвержденные директором ГНУ «ВИЭВ», академиком РАСХН Гулюкиным М.И. 15.03.10г., и методические рекомендации «Система медико-ветеринарных мероприятий в сельских очагах туберкулеза», утвержденные директором ГНУ «ВИЭВ», академиком РАСХН Гулюкиным М.И., директором ВНИТИБП, академиком РАСХН Самуйленко А.Я. и директором ФГУ «Центр ветеринарии» Л.К. Кишем в июле 2009г.

1.5. Личный вклад автора заключается в постановке цели и задач, сборе эпизоотологических данных и результатов бактериологических исследований биоматериала от животных в ветеринарных лабораториях РФ за 1961-2008гг., создании компьютерной базы данных бактериологических исследований, сборе и анализе видового состава нетуберкулезных микобактерий, выделяемых в различных регионах РФ, бактериологическом исследовании биоматериала от животных зоопарка и идентификации выделенных микобактерий, испытании новой среды ВКГ со стимулятором роста, анализе, обобщении и интерпретации полученных результатов собственных исследований и исследований, проведенных научными сотрудниками по проблеме туберкулеза и микобактериозов, в подготовке научных публикаций, участии в разработке методических рекомендаций.

1.6. Апробация работы. Материалы работы доложены на Международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Я.Р. Коваленко (г. Москва, 2006г.), на XV Московском Международном ветеринарном конгрессе (г. Москва, 2007г.), на Международной научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел» (г. Москва, 2008г.), на заседаниях ученого совета ГНУ «ВИЭВ» (2007, 2008, 2009гг.). Основные положения, выводы и практические предложения, изложенные в диссертации, обсуждены и одобрены на межлабораторном совещании научных сотрудников ГНУ «ВИЭВ» (2010г.). Материалы диссертации используются при чтении цикла лекций врачам-бактериологам ветеринарных лабораторий субъектов РФ на курсах повышения квалификации ветеринарных врачей в ФГУ «Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория».

1.7. Основные положения, выносимые на защиту. Полученные результаты исследований позволяют вынести на защиту следующие основные положения:

- результаты ретроспективного анализа изменений проявления эпизоотического процесса туберкулеза крупного рогатого скота и птицы в Российской Федерации за 1961-2008гг.;

- результаты анализа бактериологических исследований биоматериала животных в ветеринарных лабораториях РФ за 1978-2008гг.;

- видовой состав микобактерий, выделяемых в различных регионах РФ;

- распространенность микобактериозов крупного рогатого скота в субъектах РФ;

- эффективность питательной среды ВКГ для ускоренного выделения микобактерий;

- усовершенствованная схема бактериологических исследований биоматериала на туберкулез и микобактериозы крупного рогатого скота.

1.8. Публикация результатов исследований. По материалам диссертационной работы опубликовано 7 научных статей, в том числе три – в научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования РФ.

1.9. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 170 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 29 таблицами и 2 схемами. Список литературы включает 474 источника, в том числе 91 – иностранных авторов.

2. Собственные исследования

2.1. Материалы и методы исследований. Работа выполнена в 2005-2009 гг. в лаборатории микобактериозов ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко» и в отделе бактериологии ФГУ «Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория» в соответствии с заданием 02.01.01. Российской научно-технической программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований.

Банк статистической информации, необходимой для анализа проявлений эпизоотического процесса туберкулеза в Российской Федерации, формировали на основе данных официальной ветеринарной отчетности за 1961-2008гг.

При анализе проявлений эпизоотического процесса использовали методы, описанные в «Рекомендациях по методике эпизоотологического исследования» (Бакулов И.А. и соавт., 1975), в «Руководстве по общей эпизоотологии» (под редакцией И.А. Бакулова и А.Д. Третьякова, 1979), в «Методических указаниях по эпизоотологическому исследованию» (Бакулов И.А. и соавт., 1982).

Для анализа уровня бактериологических исследований, выделения и идентификации культур микобактерий в ветеринарных лабораториях Российской Федерации были собраны данные экспертиз лабораторий, результатов исследований научно-исследовательских институтов и ветеринарных станций, опубликованные в научных и научно-производственных ветеринарных печатных изданиях.

Исследовали бактериологически биоматериал от 20 голов крупного рогатого скота из неблагополучных по туберкулезу хозяйств, реагировавших на туберкулин для млекопитающих и имеющих характерные для туберкулеза изменения, 5 коров из благополучных по туберкулезу хозяйств, убитых с диагностической целью; козы; 32 животных (слон, черепаха, ящерица, птица) и 14 проб помета выгульных загонов птиц, направленных для исследований из Московского зоопарка.

Культуральные, морфологические, биохимические и биологические свойства выделенных микобактерий изучали в соответствии с методическими рекомендациями «Бактериологическая и биохимическая идентификация микобактерий» (Оттен Т.Ф., 1994), с приказом Минздрава СССР №558 от 08.06.78г. «Об унификации микробиологических методов исследований при туберкулезе» и приказом Минздрава РФ №109 от 21.03.03г. «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации», «Наставлением по диагностике туберкулеза животных» (М., 2002).

Для определения эффективности среды ВКГ со стимулятором роста для культивирования возбудителей туберкулеза и нетуберкулезных микобактерий, наряду с микобактериями, выделенными от продуктивных и зоопарковых животных, использовали референтные штаммы микобактерий: M. tuberculosis H37Rv, M. bovis 8, M. bovis BCG, M. avium 2282, M. fortuitum и M. intracellulare, а также культуру M.tuberculosis, выделенную от козы, культуру M.bovis, выделенную от крупного рогатого скота (ВИЭВ, экспертиза №79 (3/1), культуру M.avium, выделенную от свиней.

Проводили заражение морских свинок и кроликов культурами микобактерий, выращенными на среде ВКГ и на среде Левенштейна-Йенсена. Всего было использовано 48 морских свинок и 54 кролика.

Гомогенаты образцов (печень, селезенка, легкие) от морских свинок исследовали в ПЦР с использованием тест-системы «МТБ-КОМ». Кроме того, в работе использовали ПЦР-тест системы «Туб-Диф», «MAIS-Диф» и «Авиум».

Полученные в процессе цифровые показатели обрабатывали методами вариационной статистики (Ашмарин И.П., Воробьев А.А., 1962), а также при помощи программы «Statgrafics», включающей определение средней арифметической (М), ошибки средней (m), достоверности разности средних показателей (Р) с помощью критерия Стъюдента, связь между факторами определяли методом корреляционного анализа.

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Характеристика изменений эпизоотической обстановки по туберкулезу крупного рогатого скота и птицы в Российской Федерации за 1961-2008гг.

В России туберкулез крупного рогатого скота начали официально регистрировать с 1892 г., причем пораженность животных варьировала от 0,001 до 18,0 и более процентов (Я.Р. Коваленко, 1967). До коллективизации сельского хозяйства мероприятия по борьбе с туберкулезом заключались в убое больных животных с признаками общего истощения или с поражением вымени. В хозяйствах отмечали до 15-40% зараженных туберкулезом животных (И.В. Поддубский, 1967).

В 1923г. издан Ветеринарный устав РСФСР, а в 1926г. Наркомзем РСФСР принял постановление о систематической и плановой борьбе с туберкулезом. Первоначально предписывался убой животных с открытыми формами туберкулеза легких, вымени, кишечника и матки, которые определялись по результатам бактериологических исследований. Затем наставлением, утвержденным Наркомземом и Наркомздравом РСФСР в 1926г., и инструкцией, изданной Наркомземом СССР в 1932г., в основу противотуберкулезных мероприятий был положен метод Банга. В 1940г. было введено аллергическое исследование скота в качестве основного метода диагностики туберкулеза, результаты которого являлись решающими при определении состояния по туберкулезу животных и хозяйств. В предвоенные годы заболеваемость туберкулезом крупного рогатого скота снизилась до 1-1,5% и к началу 1941г. составляла в совхозах 2,4%, в колхозах – 1,5% (В.С. Киселев, 1959).

В 1956г. был принят план мероприятий по ликвидации туберкулеза крупного рогатого скота. До 1970г., в основном, были ликвидированы изоляторы больного скота, значительно снизилось количество выявляемых новых неблагополучных пунктов и практически были оздоровлены хозяйства целого ряда областей и автономных республик.

В период развития промышленного скотоводства (с 1970г.) постепенно улучшалась эпизоотическая ситуация. Если в 1961г. было выявлено 1319 новых неблагополучных пунктов, то в 1981г. - 275, что на 20,8% меньше. К началу 1986г. уменьшилось (на 35,0%) и число пунктов, остававшихся неблагополучными. Однако значительно увеличился коэффициент очаговости (с 23,7 в 1961г. до 89,0 в 1985г.) и увеличился процент обнаруженных случаев туберкулеза при убое животных.

Эпизоотическая ситуация по туберкулезу крупного рогатого скота с 1992г. проявляет тенденцию улучшения. Если на 01.01.93г. было 1264 неблагополучных пунктов, то на 01.01.09г. их осталось только 82, т.е. в 15,4 раз меньше (табл. 1).