Получение и использование антигенов дерматомицета trichophyton faviforme и гипериммунной сыворотки в диагностике трихофитии крупного рогатого скота

УДК 619:616-097:615.373:616-07:675.019.382 На правах рукописи

ЩУРИХИН БОРИС ГРИГОРЬЕВИЧ

Получение и использование антигенов дерматомицета

Trichophyton faviforme и гипериммунной сыворотки

в диагностике трихофитии крупного рогатого скота

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология,

микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата ветеринарных наук

Республика Казахстан

Астана, 2010

Работа выполнена в лаборатории ветеринарной биотехнологии НИИ биотехнологии Казахского агротехнического университета им. С. Сейфуллина и научно-исследовательской лаборатории кафедры морфологии, микробиологии и биотехнологии КазАТУ им. С. Сейфуллина Министерства сельского хозяйства Республики Казахстан.

Научный руководитель кандидат ветеринарных наук,

доцент Кухар Е. В.

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук,

профессор Гершун В.И.

кандидат ветеринарных наук,

доцент Адильбеков Ж.Ш.

Ведущая организация Казахский национальный

аграрный университет

Защита состоится 29 октября 2010 г. в 1000 часов на заседании объединенного диссертационного совета ОД 18.08.03 при Казахском агротехническом университете им. С. Сейфуллина по адресу: 010011,

г. Астана, пр. Победы, 62 тел.: 8 (7172) 31-75-64, факс: 8 (7172) 31-75-68, www.agun.kz

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке АО «Казахский агротехнический университет им. С. Сейфуллина»

Автореферат разослан « » сентября 2010 г.

Ученый секретарь объединенного

диссертационного совета,

доктор ветеринарных наук, профессор Абдрахманов Т.Ж.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

На современном этапе развития животноводства, когда Казахстан претендует на вхождение в число 50 конкурентоспособных стран мира и в ВТО, первостепенной задачей становиться увеличение производства высококачественной животноводческой продукции. Одним из путей получения животноводческой продукции является увеличение поголовья скота и повышение продуктивности сельскохозяйственных животных, совершенствование мероприятий по профилактике и искоренению инфекционных болезней.

К числу заболеваний, мешающих успешному развитию животноводства, относится трихофития, которая, несмотря на значительные успехи в борьбе с ней, имеет широкое распространение. Данное заболевание причиняет не только существенный экономический ущерб развитию животноводства, но и представляет серьезную опасность для здоровья людей.

В Казахстане возбудителями трихофитии животных в основном являются грибы родов Trichophyton и Microsporum. Основными возбудителями являются у крупного рогатого скота – T. faviforme (синоним verrucosum), у верблюдов – T. sarkisovii, T. verrucosum var autotrophycum – у овец и коз, у лошадей – T. equinum и T. mentagrophytes и др.

Заболевание наносит значительный ущерб животноводству в результате задержки роста и развития животных, порчи кож и шерсти. Если учесть большие затраты труда и средств на мероприятия, связанные с ликвидацией трихофитии, то станет ясной необходимость более серьезного отношения к ликвидации этого заболевания.

По данным Главного управления ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР к концу шестидесятых годов, из общей заболеваемости заразными болезнями крупного рогатого скота стригущий лишай составлял 39-40%, в том числе в Казахской ССР – 4,8%. До разработки специфической профилактики, трихофития крупного рогатого скота проявлялась в виде эпизоотии, нанося огромный экономический ущерб неблагополучным хозяйствам. С началом массовой профилактической вакцинации крупного рогатого скота вакциной ЛТФ-130, разработанной под руководством А.Х. Саркисова, с 1970 года позволило почти полностью предотвратить возникновение вспышек, трихофития стала проявляться спорадически. Это объясняется активным влиянием ветеринарных специалистов на движущие силы эпизоотического процесса путем изоляции больных животных, как источников возбудителя инфекции, проведением специфической терапии, повышением специфической резистентности восприимчивых животных путем систематических плановых прививок против данной инфекции. Одновременно с этим проводился комплекс ветеринарно-санитарных мероприятий, направленных на повышение общей резистентности организма и исключение механизма передачи возбудителя инфекции, что позволило существенно снизить заболеваемость трихофитией у животных на территории СССР с 42% в 1969 г. до 0,6% в 1979 г.

После распада СССР, с 1993 по 1998 годы, в АПК Республики происходил процесс разгосударствления и приватизации колхозно-совхозной собственности, результатом чего стали большой спад численности общественного животноводства, а также уменьшение численности крупного рогатого скота в личных подворьях из-за миграции сельского населения в города. С 2000 года ситуация в АПК Республики изменилась, происходит увеличение численности поголовья животных и птиц в сельскохозяйственных формированиях и личных хозяйствах. Однако нарушение централизованного снабжения биопрепаратами, химиотерапевтическими и дезинфицирующими средствами привело к изменению эпизоотической ситуации.

В Казахстане изучением трихофитии сельскохозяйственных животных занимались С.Х. Хамиев (1982-1991), А.Г. Демченко, С.С. Мадыбаев, К.К. Муканов, С.А. Турсункулов, А.Р. Сансызбай, С.Т. Толеутаева, Н.П. Иванов, Е.Н. Левченко, М. Умитжанов, А.Б. Бижанов, Е.В. Кухар и другие.

В новых условиях ведения животноводства – при различных формах собственности с ограниченным числом поголовья и закрытым типом их содержания – изменилось проявление эпизоотического процесса трихофитии. Ареал распространения трихофитии расширяется, переходя на ранее благополучные районы и регионы республики. Трихофития в настоящее время во многих коллективных, фермерских и личных хозяйствах Республики приобрела характер угрожающих эпизоотий. Исходя из вышеописанного следует, что назрела острая необходимость проведения мониторинга эпизоотической обстановки трихофитии по неблагополучным областям и регионам.

Цель и задачи исследований

Целью наших научных исследований явилось получение специфических антигенов и антител для совершенствования способов диагностики трихофитии крупного рогатого скота.

Были поставлены следующие задачи:

- проведение анализа эпизоотической и эпидемической ситуации по трихофитии в Республике Казахстан;

- получение специфического белкового антигена дерматомицета Trichophyton faviforme № 130 для постановки иммуноферментного анализа;

- получение аллергена для отработки кожной пробы с целью выявления больных трихофитией животных;

- получение гипериммунной сыворотки для использования в качестве положительного контроля в серологических реакциях.

Научная новизна

В ходе исследования был отработан способ получения белкового антигена из Trichophyton faviforme с высокой специфической активностью в ИФА.

Впервые разработана схема гипериммунизации животных с целью получения высокоактивной противотрихофитийной сыворотки для проведения серологических исследований.

Разработана техника постановки непрямого варианта ИФА для диагностики трихофитии крупного рогатого скота на основе использования белкового антигена, выделенного из T. faviforme.

Выявлено наличие колострального иммунитета к трихофитии крупного рогатого скота.

Разработан план мероприятий по профилактике трихофитии крупного рогатого скота с учетом современных особенностей ведения животноводства.

Практическая значимость работы

Белковый антиген, полученный из Т. faviforme № 130 по модифицированному методу L. Tabatabai (1979) в нашей модификации, предлагается к использованию в качестве компонента диагностических тест-систем.

Гипериммунная сыворотка предлагается к использованию в качестве положительного контроля в диагностических тест-системах при выявлении специфических антител к возбудителю трихофитии крупного рогатого скота.

Иммуноферментный анализ на основе белкового антигена предлагается к использованию ветеринарными учреждениями для серологической диагностики трихофитии крупного рогатого скота.

Данные диссертационной работы используются в учебном процессе КАТУ им. С. Сейфуллина (г. Астана) и КГУ им. А. Байтурсынова (г. Костанай) при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий у студентов по специальности «Ветеринарная медицина», «Ветеринарная санитария», «Охотоведение и звероводство», «Зоотехния». Полученные антигены и антитела используются в научно-исследовательской работе НИИ биотехнологии КАТУ им. С. Сейфуллина при подготовке курсовых и дипломных работ.

По итогам научных исследований подготовлены методические указания, получен инновационный патент.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Метод получения белкового антигена Т. faviforme.

2. Схема гипериммунизации крупного рогатого скота для получения высокоспецифичной гипериммунной сыворотки и методы её контроля.

3. Серологическая диагностика трихофитии с использованием иммуно- ферментного анализа.

4. Колостральный иммунитет при трихофитии.

Апробация работы

Основные результаты работы были представлены на Республиканских научно-теоретических конференциях «Сейфуллинские чтения – 3, 4, 5, 6», (Астана, 2007-2010); Международной научно-практической конференции «Современные средства и методы диагностики, профилактики и лечения инфекционных, протозойных и микотических болезней сельскохозяйственных и промысловых животных, рыб и пчел», посвященной 100-летию со дня рождения академика ВАСХНИЛ А.Х. Саркисова (Москва, 2009); заседаниях Научно-технического совета КАТУ им. С. Сейфуллина (Астана, 2008, 2009), ежегодных заседаниях ученого совета факультета ветеринарии и технологии животноводства КАТУ им. С. Сейфуллина (Астана, 2007-2009).

Публикации

На основе материалов диссертации опубликовано 12 научных работах, а также получен 1 инновационный патент.

Объем и структура диссертации

Объем диссертации – 132 страница. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, списка литературы и приложений. Список использованных источников включает 253 наименования, в том числе 13 иностранных. Материалы иллюстрированы 26 таблицами и 16 рисунками.

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

В главе «Выбор направления исследований» обосновывается необходимость проведения исследований по повышению качества и эффективности диагностических мероприятий при трихофитии крупного рогатого скота.

В главе «Процесс теоретических исследований» раскрываются вопросы истории изучения трихофитии, особенности эпизоотологического процесса при трихофитии, методы диагностики и виды иммунитета при трихофитии, биопрепараты, используемые в диагностике трихофитии.

Условия проведения исследований

Работа выполнена в лаборатории ветеринарной биотехнологии НИИ биотехнологии КАТУ им. С. Сейфуллина и на кафедре морфологии, микробиологии и биотехнологии КАТУ им. С. Сейфуллина МСХ РК по теме «Дифференциальная диагностика дерматомикозов», выполнявшейся с 2002 по 2009 гг. (№ госрегистрации 0102 РК 00093 от 22.04.02 г.), и по программе 042 «Прикладные научные исследования в области агропромышленного комплекса» (Ветеринария)» с 2006 по 2008 гг. по заданию: 08.05.01.01 «Разработка иммуноферментной тест-системы для дифференциальной диагностики дерматомикозов животных и индикации антигена в объектах внешней среды» (№ госрегистрации 0106РК01270 от 2006 г.).

Гипериммунизация продуцентов проводилась на базе ТОО «АФ «Родина» Целиноградского района.

Материалы исследований

При проведении эпизоотического исследования использованы архивные материалы ветеринарной и медицинской отчетности, аналитические и обзорные научные статьи.

В работе использованы:

- вакцинный штамм T. faviforme 130;

- питательные среды Сабуро для культивирования дерматомицетов;

- 1% раствор агарозы для постановки реакции преципитации;

В качестве антигена для иммунизации животных-продуцентов с целью получения гипериммунной сыворотки использовали вакцинный препарат ЛТФ-130.

В серологических реакциях использовали следующие антигены:

- корпускулярный антиген - вакцина ЛТФ-130 в концентрации 1·105 кл/см3 (100 тыс клеток в мл); растворимые белковые и полисахаридный антигены дерматомицета T. faviforme; родственных грибов-дерматомицетов, Asp. flavus, а так же туберкулин и единый бруцеллёзный антиген;

- для постановки РГА и РНГА использовали эритроциты барана и кролика в концентрации 0,5; 0,85; 1,0%;

- для постановки аллергической пробы использован аллерген по методу Плято-Нейссера и антиген по методу L. Tabatabai (1979).

В качестве адъювантов использованы полный и неполный адъюванты Фрейнда, левамизол, катазал.

В работе использовано:

- животные: мыши беспородные 6-8 недельного возраста – 71 голова; бычки в возрасте 6-8-ти месяцев - 40 голов; новорожденные телята - 10 голов; крупный рогатый скот различных возрастных групп от 2-3-х месяцев до 5-7 лет - 136 голов;

- сыворотки крови крупного рогатого скота из хозяйств Акмолинской, Костанайской, Северо-Казахстанской областей в количестве 1559 проб.

Сыворотка крови животных подвергалась серологическому анализу в РМА, РИД, РГА, РНГА, непрямом варианте ТИФА.

Методы исследований

В работе применялись эпизоотологические, биохимические, серологические, иммунологические и статистические методы.

Анализ эпизоотической ситуации по трихофитии крупного рогатого скота проводили путем собственных исследований, включающих анализ ветеринарной статистики за 20 лет, и изучения литературы по вопросам трихофитии, проведения анкетирования, подворных обходов и иммунологического исследования сывороток крови. Эпидемическая ситуация по трихофитии анализировалась на основании собственных исследований, статистических данных МЗ РК и научных источников.

Выделение растворимых белков клеточной стенки дерматомицета Т. faviforme проводили экстракцией цитратным буфером по методу L. Tabatabai (1979) в нашей модификации. Концентрацию белка определяли по методу Bradford M.M. (1976), а концентрацию углеводов в растворе антигена - с помощью пробы Молиша (сернокислотным методом).

Получение аллергена из дерматомицета T. faviforme методом проводили методом Плято-Нейссера. Очистку антигенов осуществляли методами фильтрации через асбестовый фильтр и низкоскоростного центрифугирования.

Контроль физических и биологических свойств биопрепаратов делали по общепринятой схеме.

Белых (беспородных) мышей иммунизировали в течение двух недель по схеме И.И. Фридлянской (1988). Грундиммунизацию бычков проводили в 2-х месячном возрасте вакциной ЛТФ-130 по общепринятой схеме в профилактических дозах. Для проведения гипериммунизации бычков иммунизировали с добавлением в вакцинный препарат иммуностимуляторов, животных контрольной группы – без использования иммуностимуляторов.

При анализе активности и специфичности гипериммунной сыворотки применяли серологические реакции: РИД по O. Оuchterlony, РКА, РМА, РГА, РНГА, ИФА по общепринятым методикам. Для проведения иммунологического мониторинга трихофитии крупного рогатого скота использовали непрямой вариант ИФА.

Постановку аллергической пробы проводили методом скарификации и внутрикожным введением биопрепаратов на белых мышах, кроликах и телятах 3-8 месячного возраста. Результаты учитывали через 1, 24, 48 и 72 часа.

Для обработки полученных данных использовались стандартные классические методы анализа проверки статистических гипотез. Статистический анализ результатов серологических исследований проводили по методу, описанному Т.С. Сайдулдиным (1981) с использованием мастера функций в категории «Статистические» программы Microsoft Excel. Достоверными считали различия при Р 0,05.

Результаты исследования

Обоснование необходимости проведения экспериментальных работ

Статистический анализ данных отчетности по заболеваемости дерматомикозами в РК свидетельствует о продолжающемся наступлении микозов в последнее время. Это связано с ухудшением экологической ситуации в целом, бесконтрольным применением антибиотиков, неправильным и несбалансированным питанием и другими причинами. Возросли не только число и тяжесть грибковых инфекций, но также разнообразие грибов, выявленных в качестве этиологического фактора. Кроме грибов, традиционно имеющих клиническую значимость и вызывающих большую часть микозов у человека и животных, появились «современные» возбудители, которые вызывают болезни в организме с ослабленной иммунной системой.

Это послужило основанием проанализировать эпизоотическую ситуацию заболеваемости трихофитией крупного рогатого скота. В процессе исследований нами выяснено, что трихофития встречается повсеместно, однако официально эта информация не отражается.

Анализ заболеваемости животных трихофитией позволил выявить имеющиеся проблемы и разработать план мероприятий по их решению. Одним из предлагаемых методов является серологический мониторинг, для проведения которого требуется наличие стандартной активной тестирующей системы.

Для постановки серологических реакций необходимы антигены и специфические сыворотки, которые должны обладать строгой специфичностью и высокой чувствительностью. Полученные антигены и антитела применяли для постановки непрямого варианта твердофазного ИФА.

На первом этапе нами был проведен анализ эпизоотической и эпидемической ситуации по трихофитии крупного рогатого скота и дерматомикозам у людей. На следующем этапе провели отработку технологии получения специфического антигена и аллергена, их характеристику и использование в соответствующих тестах. Очередным этапом было получение гипериммунной сыворотки и её характеристика. На заключительном этапе были отработаны параметры постановки непрямого варианта иммуноферментного анализа с полученными нами компонентами и проведено испытание диагностического теста для выявления специфических антител в сыворотке крови животных в производственном опыте. В результате чего определена возможность его использования для серологической диагностики трихофитии крупного рогатого скота.

При отработке параметров иммуноферментного анализа нами было выявлено наличие колострального иммунитета у новорожденных телят к возбудителю трихофитии, информация о котором в доступной нам литературе отсутствует.

Изучение эпизоотической и эпидемической ситуации по трихофитии в Республике Казахстан

Анализ статистических данных МСХ и Министерства здравоохранения РК, архивных данных за последние 20 лет по Акмолинской и Костанайской областям, данных годовых отчетов в областных территориальных управлениях МСХ РК показал, что официальные статистические данные о степени распространения дерматомикозов среди восприимчивых животных за двадцатилетний период по Республике Казахстан отсутствуют. Официально представлена информация о проведении профилактических мероприятий по трихофитии сельскохозяйственных животных.