Получение и использование моноклональных антител в диагностике гриппа птиц

УДК 616.98:578.832.1 На правах рукописи

АКАНОВА ЖАННАРА ЖУЛЬДАСОВНА

ПОЛУЧЕНИЕ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ В ДИАГНОСТИКЕ ГРИППА ПТИЦ

16.00.03 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата ветеринарных наук

Республика Казахстан

Астана, 2010

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте биотехнологии и на кафедре морфологии, микробиологии и биотехнологии, Казахского агротехнического университета им. С.Сейфуллина.

Научные руководители:	доктор ветеринарных наук Булашев А.К. кандидат биологических наук Боровиков С.Н.
Официальные оппоненты:	доктор ветеринарных наук, Никитин Е.Б.
	кандидат ветеринарных наук, Блейм Т.Н.
Ведущая организация	Казахский национальный аграрный университет

Защита состоится 14 декабря 2010 г. в 1400 часов на заседании диссертационного совета ОД 18.08.03 при Казахском агротехническом университете им. С.Сейфуллина по адресу: 010011, г. Астана, ул. А. Молдагуловой 29а, малый конференц-зал тел.: 8 (7172) 31-75-64, факс: 8 (7172) 31-75-68, www.agun.kz

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казахского агротехнического университета им. С.Сейфуллина.

Автореферат разослан «12» ноября 2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор ветеринарных наук Абдрахманов Т.Ж.

Введение

Актуальность проблемы. Грипп птиц - высококонтагиозное остропротекающее заболевание с поражением респираторного и желудочно-кишечного трактов, протекающее в виде сезонных энзоотий и эпизоотий домашних, синантропных и диких птиц, как правило, с высоким уровнем летальности, являющейся причиной эпидемий и пандемий людей. Эта болезнь по своей опасности относится к списку А (Бакулин В.А., 2006). Уникальным возбудителем гриппа животных является вирус гриппа рода А, который об­ладает способностью изменять свою антигенную структуру и патогенность в отношении разных биологических видов.

Эпизоотическую и эпидемиологическую обстановку по птичьему гриппу в мире можно оценить как неблагоприятную. Заболевание распространено повсеместно. В последнее время оно зарегистрировано более чем в 50 странах мира (Турции, Китае, Вьетнаме, Индонезии, Камбодже, Румынии, Украине, России, Казахстане и др.) (Смиян Ю.П., 1987, Беляев А.Л., Слепушкин А.Н., 2004).

Данное заболевание было зарегистрировано и в нашей республике, где с 22 июля по 17 августа 2005 года были зафиксированы 7 очагов вспышки гриппа среди домашних птиц в четырех областях (Павлодарской, Акмолинской, Карагандинской и Северо-Казахстанской), вызванные высокопатогенным штаммом вируса Н5N1. По всем неблагополучным пунктам было изъято и уничтожено 12 860 голов домашней птицы (Матвеева В.М., Белоусов В.Ю., 2008).

В связи с тем, что последние эпизоотии гриппа птиц привели к заболеванию людей с высоким процентом летальности, проблема своевременной лабораторной диагностики стала особенно актуальной для ветеринарных и противоэпидемических служб всего мира (Макаров В.В. и соавторы, 2005).

Одним из наиболее важных мероприятий, проводимых против эпизоотии гриппа, является своевременная и точная диагностика. Для диагностики применяется достаточное количество тестов, из которых выделяется иммуноферментный анализ (ИФА), обладающий рядом достоинств, позволяющих ему находить практическое применение. Однако недостатком метода является использование поликлональных антител, что снижает специфичность и является препятствием при внедрении в практику. Хорошей возможностью решения этой проблемы может служить использование одного из направлений биотехнологии – гибридомной техники получения моноклональных антител (МКА). Преимуществом МКА является строгая направленность к одной антигенной детерминанте, постоянный аффинитет и физико-химические характеристики, возможность наработки препарата в неограниченном количестве. Опыт использования этих чувствительных и высокоспецифичных тестов в диагностике вирусных и бактериальных инфекций показал, что их внедрение в практику значительно повышает эффективность работы.

Для разработки диагностической тест-системы с требуемыми показателями необходимо предварительное получение её компонентов – специфического антигена и моноклональных антител. Значимым этапом при разработке компонентов с высокой эффективностью и чувствительностью для тест-систем является отработка оптимальной схемы постановки реакции и изучение её параметров. Проведение указанных выше исследований и решение поставленных задач позволит отработать технологию получения компонентов тест-системы для диагностики высокопатогенного гриппа птиц (ВГП).

Цель и задачи исследований

Целью настоящей работы является получение моноклональных антител к антигенам вируса гриппа птиц типа А штамма H5N1 с целью разработки варианта иммуноферментного анализа для выявления специфических антител в сыворотке крови птиц.

В соответствие с целью были поставлены следующие задачи:

1. Отработать схему получения и очистки антигена вируса гриппа птиц.
2. Получить и наработать in vitro и in vivo моноклональные антитела к диагностически ценным антигенам вируса гриппа птиц.
3. Изучить основные иммунохимические свойства полученных моноклональных антител.
4. Оптимизировать условия применения моноклональных антител в различных вариантах ИФА для выявления специфических антител в сыворотке крови птиц.
5. Апробировать диагностическую ценность ИФА на основе моноклональных антител для серологической диагностики гриппа птиц.

Научная новизна

Впервые получен штамм гибридных культивированных клеток Mus. Мusculus L. – продуцент моноклональных антител к белковому антигену гриппа птиц типа А штамма H5N1 с молекулярной массой 36 кД.

Определены научные основы технологии изготовления иммуноферментной тест-системы на основе моноклональных антител для серологической диагностики ВГП.

Практическая значимость работы

Штамм гибридных культивируемых клеток – продуцент моноклональных антител к белковому антигену ВГП штамма H5N1 с авторским названием Mab/INF-1А9 (регистрационный номер C-RKM-0279) депонирован в ДГП «Республиканская коллекция микроорганизмов» (г. Астана) и предлагается для использования в разработке методов диагностики гриппа.

Для серологической диагностики высокопатогенного гриппа птиц предложены методические рекомендации по применению тест-системы ИФА на основе моноклональных антител.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Характеристика штаммов гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела к антигену ВГП типа А штамма H5N1.
2. Иммунохимические свойства моноклональных антител, специфичных к детерминанте белкового антигена ВГП с молекулярной массой 36 кД.
3. Иммуноферментная тест-система на основе моноклональных антител для серологической диагностики высокопатогенного гриппа птиц.

Апробация. Основные результаты работы доложены на Международной научно-практической конференции, посвященной 50-летию основания АО «Казахский агротехнический университет имени С. Сейфуллина» (г. Астана, 2007); на республиканской научно-теоретической конференции «Сейфуллинские чтения» (г. Астана, 2007, 2008, 2009).

Публикации. Материалы диссертационной работы опубликованы в 4 научных работах и методической рекомендации «Тест-система ИФА на основе моноклональных антител для серологической диагностики высокопатогенного гриппа птиц».

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических предложений, списка использованной литературы и приложений. Список использованных источников включает 225 наименований, в т.ч. иностранных – 70. Материалы иллюстрированы 9 таблицами и 16 рисунками.

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

Работа выполнена в течение 2006-2009гг. в Научно-исследовательском институте биотехнологии КАТУ им. С.Сейфуллина.

В основу настоящей диссертационной работы положены материалы, полученные в результате выполнения проекта: «Получение моноклональных антител к вирусу высокопатогенного гриппа птиц и разработка на их основе диагностической тест-системы» в рамках программы «Разработка современных технологий для формирования кластера по биотехнологии в Республике Казахстан на 2006-2008 годы».

Отдельные фрагменты работы проводились в Государственном Учреждении «Национальный референтный центр в ветеринарии» КГИ в АПК МСХ РК (получение аллантоисной жидкости), «Национальном центре биотехнологии» МОН РК (очистка и концентрирование антигена методом ультрацентрифугирования), в Научно-исследовательском институте проблем биологической безопасности НЦБ МОН РК (электронное микроскопирование).

Материалы и методы исследования

В экспериментах были использованы следующие животные: белые мыши беспородные в количестве 125 голов и 30 мышей линии BALB/c 7-8 недельного возраста, 5-7 месячные кролики в количестве 2 головы с живой массой 2,5-3,0 кг.

В работе использован вакцинный препарат из эмульгированной инактивированной вакцины штамма Н5 (г. Владимир), коммерческий антиген Н5N1 (референс-лаборатория по гриппу птиц Института зоопрофилактики, Италия) и антиген из аллантоисной жидкости куриных эмбрионов, зараженных вирусом полевого штамма Н5N1.

При определении специфичности моноклональных антител в иммуноферментном анализе были использованы: панель штаммов референс-антигенов: Н5N1, H1N1, H3N8, H4N8, H5N2, H7N3, H9N7, H10N1, H11N9, H12N5, H13N6, H14N5, H15N6 (референс-лаборатория по гриппу птиц Института зоопрофилактики, Италия), антигены вируса болезни Ньюкасла, антигены вируса болезни Гамборо, инфекционного ларинготрахеита, болезни Ауески штамм «УБ-95».

Коммерческие наборы для диагностики гриппа птиц: ИФА «Influenzu A. IDVET» для выявления антител вируса гриппа птиц конкурентным методом (производство Франция), ИФА для обнаружения специфических антител («Biotech Group» Казахстан), тест-система «Грипп» для выявления вируса гриппа животных и птиц с последующей идентификацией гемагглютининов Н5 и Н7 методом классической полимеразной цепной реакции (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, РФ), иммунохроматографические тесты для выявления вируса гриппа птиц типа А, подтипа Н5 (фирма Antigen, Корея) и (фирма СerTest, Испания).

Получение антигенных препаратов: Антиген №1. К вакцине эмульгированной, инактивированной против гриппа птиц штамма Н5 (г. Владимир, Россия) добавляли равный объем 96% и 70% этилового спирта, перемешивали в течение 2ч. при комнатной температуре и центрифугировали при 3000 об/мин. В результате наблюдали образование трех фракций, которые использовали в качестве антигенов (соответственно, 1, 2, 3 фракция антигена №1).

Антиген №2. Коммерческий лиофилизированный антиген вируса гриппа птиц штамма Н5N1 (Италия), серия 47/08, который ресуспендировали в 1 мл дистиллированной воды.

Антиген №3. Для получения антигена, осветленную аллантоисную жидкость, концентрировали высокоскоростным центрифугированием (Beckman L8-80M, тип ротора SW 27) при 27 000 об/мин в течение 2 часов при +4 С. Осадок ресуспендировали в ЗФР и продолжали очистку в градиенте плотности сахарозы (20, 40, 60%) с тем же режимом ультрацентрифугирования. Для дальнейшей работы отбирали опалесцирующую фракцию, отмывали от сахарозы. Концентрацию белка определяли по методу Бредфорд (1976).

Электрофорез белковых антигенов проводили в 7% и 10% полиакриламидном геле по методу J. Laemmli et al. (1970). Электрофоретический перенос антигенов из геля на нитроцеллюлозную мембрану осуществляли с помощью прибора для иммуноблотинга по методу Н. Towbin et al. (1979).

Гибридомная техника. Иммунизацию лабораторных животных (мышей) проводили по методу И.И. Фридлянской (1987). Мышам в первый день иммунизации вводили внутрибрюшинно по 100 мкг антигена в 0,1 мл неполного адъюванта Фрейнда (Sigma, США). На 7, 11, 12, 13 дни иммунизации животным инъецировали по 100 мкг антигена в забуференном физиологическом растворе, рН 7,2-7,4.

Гибридомы получали путем слияния лимфоцитов мышей линии BALB/c, стимулированных антигеном вируса гриппа птиц штамма H5N1 с клетками миеломной линии Х63 – Ag 8.653. В качестве сливающего агента использовали раствор полиэтиленгликоля с молекулярной массой 4000 (ПЭГ-4000). Методом лимитирующих разведений (J. Coding et. al., 1980) клонировали гибридные клетки. Методом высаливания насыщенным раствором сульфата аммония, выделяли полученные иммуноглобулины из асцитной жидкости.

Активность и специфичность полученных моноклональных антител определяли в непрямом варианте ИФА. Константу связывания моноклональных антител устанавливали по методу J. Beatty (1987). Класс и подкласс моноклональных антител определяли в реакции двойной иммунодиффузии по методу O. Ouchterlony (1958) с использованием моноспецифических сывороток.

Постановку иммуноферментного анализа проводили по общепринятой методике.

Результаты исследований

Получение и характеристика антигенов гриппа птиц

Проведены исследования по возможности получения антигена вируса гриппа птиц методом спиртовой преципитации из вакцинного препарата. В результате наблюдали образование двух жидких фракций, и осадка. В лабораторных условиях изучали белковый состав двух жидких фракций вакцинного антигена, для чего использовали метод электрофореза. В результате установлено, что во фракциях №2 после обработки 70% и 96% этиловым спиртом, имеются белки, молекулярная масса которых равна 24 кД.

Для получения иммунной сыворотки нами были иммунизированы полученным антигеном лабораторные мыши по схеме Фридлянской (1987). После окончания иммунизации сыворотка мышей была использована при изучении активности полученных фракций антигена в реакции иммунодиффузии.

В реакции иммунодиффузии между фракцией №2 антигена, позитивной референс – сывороткой и сывороткой иммунной мыши, образовался преципитирующий комплекс, выражающийся образованием четкой линии преципитации. Так же наблюдали появление «размытой» линии преципитации между первой фракцией, полученной обработкой 70% этиловым спиртом, и позитивной референс – сывороткой.

В дальнейшей работе была использована вторая фракция антигена, полученного при обработке вакцины 70% этиловым спиртом. Выход вируссодержащий жидкости составил 5,0 мл с концентрацией белка 0,5 мг/мл. Результаты изучения активности белковых фракций в реакции иммунодиффузии приведены в таблице 1.

Таблица 1 – Результаты изучения активности белковых фракций в РИД

Исследуемый материал	96% этиловый спирт			70 % этиловый спирт
	1	2	3	1	2	3
Сыворотка иммунизированных мышей	-	+	-	±	+	-
Позитивная специфическая референс сыворотка к H5N1	-	+	-	-	+	-
Сыворотка неиммунных мышей	-	-	-	-	-	-