Разработка технологии ферментного препарата l-арабинозоизомераза для получения d-тагатозы

На правах рукописи

ВОЕВОДИНА ОЛЬГА СЕРГЕЕВНА

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА L-АРАБИНОЗОИЗОМЕРАЗА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ D-ТАГАТОЗЫ

Специальность 05.18.07 - Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата технических наук

Москва – 2011

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования

«Московский государственный университет пищевых производств»

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор

Иванова Людмила Афанасьевна

Официальные оппоненты: доктор технических наук, доцент

Милорадова Елена Васильевна

кандидат технических наук

Черепенникова Екатерина Борисовна

Ведущая организация: ГНУ ВНИИ Пищевой биотехнологии РАСХН

Защита состоится: « 20 » декабря 2011 г. в 11.30 ч. в ауд. 302 на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.148.04 при ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств» по адресу: 125080, Москва, Волоколамское шоссе, д. 11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «МГУПП».

Автореферат отправлен по адресу referat_vak@mon.gov.ru для размещения в сети Интернет Министерством образования и науки РФ и размещен на сайте www.mgupp.ru.

Отзыв на автореферат в двух экземплярах, заверенных печатью учреждения, просим направлять по адресу: 125080, Москва, Волоколамское шоссе, д. 11, МГУПП, ученому секретарю диссертационного совета Д 212.148.04.

Автореферат разослан « ___ » ноября 2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, к.т.н. Тимофеев Д.В.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

В условиях современного ритма жизни потребление сахара неуклонно растет. Но каждый знает, что калорийность сахара достаточно велика, и если человек живет в условиях сниженных энергозатрат, то избыток калорий превращается в жир, в результате чего у большинства населения возникает угроза ожирения и сахарного диабета. При чрезмерных дозах употребления сахароза может привести к тяжелым нарушениям углеводного и жирового обмена, а также способствовать развитию различных заболеваний.

Натуральные заменители сахара такие, как фруктоза, ксилит и сорбит отличаются довольно высокой калорийностью, поэтому были синтезированы низкокалорийные искусственные подсластители, которые превосходят сахар по сладости, но никак не влияют на выброс инсулина и уровень сахара в крови. Однако искусственные подсластители имеют ряд недостатков, поэтому в настоящее время всё чаще возникает вопрос о пользе и безопасности этих соединений.

В связи с этим во многих странах проводят исследования по разработке технологии безопасного и эффективного низкокалорийного подсластителя, применение которого возможно для широкого ассортимента пищевых продуктов и разновозрастного круга населения.

D-тагатоза - полностью натуральный сахар, представляющий собой моносахарид, используемый как подсластитель. D-тагатоза фактически не отличается по вкусу от сахарозы, но с точки зрения более быстрого ощущения сладости подобна фруктозе. Её сладость составляет около 0,9 ед. от сладости сахарозы, принятой за 1,0. D-тагатоза имеет невысокую калорийность (1,5 ккал/г), в отличие от других заменителей сахарозы она лишена слабительного эффекта.

Для ферментативной конверсии D-галактозы в D-тагатозу используют фермент L-арабинозоизомераза, не обладающий выраженной субстратной специфичностью. В настоящее время в РФ производство D-тагатозы отсутствует, хотя в данном направлении проводятся исследования. Тем не менее, нарастает интерес к этому уникальному заменителю сахарозы во всех странах, в том числе и РФ. Поэтому разработка новых научно-обоснованных биотехнологий производства ферментного препарата L-арабинозоизомераза с целью получения D-тагатозы актуальна и перспективна.

Настоящая работа посвящена разработке биотехнологии ферментного препарата L-арабинозоизомераза для получения D-тагатозы.

Цель и задачи исследования.

Основная цель диссертационной работы состояла в поиске нового активного продуцента L-арабинозоизомеразы, разработке технологии очищенного ферментного препарата L-арабинозоизомераза Г10х для трансформации D-галактозы в D-тагатозу.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

• скрининг микроорганизмов-продуцентов L-арабинозоизомеразы, выделенных из природных мест обитания, с целью отбора штамма, обладающего наибольшей L-арабинозоизомеразной активностью;
• идентификация штамма-продуцента L-арабинозоизомеразы на основании изучения совокупности его морфологических, культуральных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик;
• подбор наиболее эффективного состава питательной среды и условий культивирования на основе изучения физиолого-биохимических особенностей штамма-продуцента;
• разработка технологии получения ферментного препарата L- арабинозоизомераза Г10х;
• наработка ферментного препарата L-арабинозоизомеразы в опытно-промышленных условиях;
• изучение основных параметров действия ферментного препарата L- арабинозоизомераза Г10х и его апробация как катализатора при биотрансформации D-галактозы в D-тагатозу.

Научная новизна работы.

Проведен направленный скрининг микроорганизмов с L- арабинозоизомеразной активностью, выделенных из различных видов почв.

В результате скрининга для исследований отобран штамм-продуцент L-арабинозоизомеразы с максимальной активностью (25,30 ед.АиС/г). На основании изучения совокупности морфологических, культуральных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик исследуемой культуры новый штамм, продуцирующий L-арабинозоизомеразу, идентифицирован как Bacillus mojavensis Х2.

На основе анализа экспериментальных данных и выявленных зависимостей накопления бациллярным штаммом Bacillus mojavensis Х2 L-арабинозоизомеразной активности от условий культивирования, а также выхода фермента, от параметров дезинтеграции биомассы, выделения и его очистки, впервые в РФ научно-обоснована биотехнология ферментного препарата L-арабинозоизомераза Г10х для трансформации D-галактозы в D-тагатозу.

Практическая значимость и реализация результатов работы.

В результате скрининга почвенных изолятов бактерий, обладающих L-арабинозоизомеразной активностью, создана лабораторная коллекция микроорганизмов, синтезирующих внутриклеточную L-арабинозоизомеразу. На основе наиболее перспективного штамма коллекции Bacillus mojavensis Х2 разработана биотехнология получения ферментного препарата L-арабинозоизомераза Г10х.

Разработаны проекты Лабораторного регламента и Технических условий на ферментный препарат L-арабинозоизомераза Г10х. Проведена наработка препарата L-арабинозоизомераза Г10х в условиях опытного производства. Выход препарата составил 6,8г/дм3, активность ферментного препарата L-арабинозоизомераза Г10Х – 772 ед.АиС/г. Полученные результаты подтверждены актом ЗАО «Фармацевтическая фирма «Лекко».

Проведена апробация каталитического действия полученного препарата L-арабинозоизомераза Г10Х в лабораторных условиях. В результате изомеризации D-галактозы под действием L-арабинозоизомераза Г10х получена D-тагатоза с выходом 34,81%, что соответствует разработкам зарубежных ученых.

Апробация работы.

Основные положения работы докладывались на Российских и международных конференциях и симпозиумах: Общеуниверситетской научной конференции молодых ученых и специалистов (Москва, 2009); VII Международной научно-практической конференции и выставки "Технологии и продукты здорового питания. Функциональные пищевые продукты"; конференции молодых ученых "Инновационные технологии продуктов здорового питания" (Москва, 2009); III Международной научно-технической конференции «Инновационные технологии и оборудования для пищевой промышленности (приоритеты развития)» (Воронеж, 2009); Московской Международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов» (Москва, 2010); Международном симпозиуме «Перспективные биокатализаторы для перерабатывающих отраслей АПК» (Москва, 2010); VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, где отражены основные положения диссертации

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, включающего 201 источник, и 5 приложений. Работа изложена на 148 страницах машинописного текста, включает 34 таблиц и 51 рисунок.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В литературном обзоре освещена история разработок функциональных продуктов питания, пищевых и биологически активных добавок. Рассмотрены основные сахарозаменители и подсластители и способы их получения. Описаны свойства заменителя сахарозы - D-тагатозы, способы его получения, также приведены примеры использования в пищевой и фармацевтической отраслях промышленности. Описан метаболизм D-тагатозы. Приведена сравнительная характеристика ферментов D-ксилозоизомеразы и L-арабинозоизомеразы, катализирующих реакции изомеризации. Описаны характеристики фермента L-арабинозоизомеразы, выделенного из разных микроорганизмов. Приведены данные по иммобилизации фермента L-арабинозоизомераза.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. Материалы и методы исследований

Образцы почвы для скрининга. В качестве природных источников изолятов бактерий использовались образцы почв: Московской, Тамбовской, Псковской, Новгородской областей, Краснодарского края, а также образцы почв, привезенные из Казахстана, Туркменистана, Вьетнама, Египта и острова Крит. С момента отбора материал хранили при температуре +4°С в течение 1-3 месяцев.

Скрининг микроорганизмов-продуцентов фермента L-арабинозоизомеразы, выделенных из природных мест обитания. Скрининг микроорганизмов - продуцентов L-арабинозоизомеразы, проводили согласно схеме, разработанной сотрудниками кафедры «Биотехнология» ФГБОУ ВПО МГУПП.

Питательные среды.

Среды, используемые для культивирования бактерий. Среда «А», %: L-арабиноза – 0,5; пептон – 0,5; дрожжевой экстракт – 0,5; K2HPO4 – 0,5; MgSO4*7H2O – 0,02; (NH4)2SO4 – 0,01. Среда «Б», %: L-арабиноза – 0,5; пептон – 0,5; дрожжевой экстракт – 0,3; K2HPO4 – 0,5; MgSO4*7H2O – 0,02; (NH4)2SO4 – 0,02. Среда «В», %: L-арабиноза – 0,5; пептон – 0,5; дрожжевой экстракт – 0,3; K2HPO4 – 0,5; MgSO4*7H2O – 0,02; (NH4)2SO4 – 0,02.

Среды, используемые для проведения идентификации бактерий. Для идентификации бактерий использовали питательные среды производства ФГУП ГНЦ ПМ, п. Оболенск.

Морфология клетки. Морфологию, подвижность и размеры клеток исследовали с помощью фазовой оптической микроскопии на микроскопах МИКМЕД 5, БИОЛАМ.

Фенотипическая характеристика. Изучение морфологических и физиолого-биохимических характеристик выделенных культур проводили, руководствуясь общей стратегией фенотипической дифференциации, описанной в руководствах: «Определитель бактерий» (Bergey’s manual, 1997), «Методы общей бактериологии (Герхард, 1983).

Определение последовательностей гена 16S rRNA. Идентификация проводилась путем анализа секвенсов вариабельных участков 16S rRNA, а также ПЦР анализа с использованием видоспецифических праймеров сотрудниками ФГУП «ГосНИИГенетика».

Количественный метод определения активности L-арабинозоизомеразы. Измерение активности L-арабинозоизомеразы проводили цистеин-карбазольным методом (Dische Z, Borenfreund E, 1951).

Ферментные препараты. Поликанесцин (АС – 730 ед/г, ПС – 398 ед/г, -ГкС – 120 ед/г, ЦС – 8 ед/г); Амилосубтилин (АС – 896 ед/г, ПС – 19 ед/г); Протооризин (АС – 421ед/г, ПС – 900 ед/г); МЭК (АС – 620 ед/г, ПС – 475 ед/г, -ГкС – 310 ед/г, КС – 50 ед/г, ЦС – 19 ед/г); лизоцим - 26574 ед/мг.

Газовая хроматография. Анализ продуктов ферментативной биотрансформации D-галактозы проводили на хроматографе SHIMADZU GS 2010 c масс селективным детектором QP 2010 (газ-носитель – гелий, скорость потока 1,0 мл/мин, библиотека масс спектров – NIST 05) в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН.

Статистическая обработка данных проводилась с использованием программ Statistica 6.0 и Microsoft Excel 2007, в работе представлены средние результаты с достоверностью 95%.

3.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.2.1. Скрининг микроорганизмов-продуцентов L-арабинозоизомеразы из природных мест обитания

В результате проведенных исследований выделены более 100 изолятов культур микроорганизмов, полученных высевом почвенных вытяжек на плотные элективные среды с L-арабинозой и различными значениями рН для алкалофильных, нормофильных и ацидофильных микроорганизмов. Проведена проверка полученных культур микроорганизмов на способность синтезировать фермент L-арабинозоизомеразу цистеин-карбазольным методом. На основании полученных результатов для дальнейших исследований отобран 1 штамм КБ4, обладавший наибольшей активностью среди исследованных штаммов – 25,30 ед.АиС/г.

3.2.2. Исследование фенотипических признаков и идентификация штамма КБ4, продуцента L-арабинозоизомеразы

В результате исследования морфологических и культуральных признаков штамма КБ4 выявлено, что выделенный во время скрининга штамм принадлежит к аэробным бактериям палочковидной формы. Бактерии размером 0,2-0,33,0-0,5 мкм, грамположительные, подвижные, образующие эндоспоры, на плотной среде формируют круглые колонии диаметром от 2,0 до 3,0 мм, поверхность колоний гладкая, с матовой непрозрачной структурой. Цвет колоний молочно-бежевый, молочно-желтый, профиль выпуклый, край колоний зубчатый. Рост по «штриху» четко видный, плотный, сплошной на богатых питательных средах; состоящий из отдельных колоний на бедных питательных.

Морфологические и культуральные признаки исследуемой культуры при сравнении её с тест-культурой позволяли отнести ее к бактериям рода Bacillus.

Для выявления видовой принадлежности изучались физиолого-биохимические признаки: потребление углеводов и сахаро-спиртов, отношение к кислороду, отрицательная реакция Фогес-Проскауэра, каталазная активность. На основании полученных данных установлено, что исследуемый микроорганизм принадлежит к роду Bacillus.

Для достоверности идентификации были изучены филогенетические особенности культуры. Секвенс 16S rRNA, проведённый поиск гомологичных последовательностей с построением филогенетического дерева (рис.1) и ПЦР анализ с использованием видоспецифических праймеров показали, что выделенный нами штамм с точностью 99% относится к роду Bacillus вида mojavensis.

Рис.1. Филогенетическое дерево с гомологичными штаммами.

Unknown – исследуемый штамм

Таким образом, на основании изучения совокупности морфологических, культуральных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик исследуемой культуры, новый штамм, продуцирующий внутриклеточный фермент L-арабинозоизомеразу, идентифицирован как Bacillus mojavensis Х2.

3.2.3. Определение наиболее эффективного состава питательной среды для биосинтеза L-арабинозоизомеразы бактериальным штаммом Bacillus mojavensis Х2

Первичные исследования биосинтеза L-арабинозоизомеразы проводились при культивировании Bacillus mojavensis Х2 на среде «А», состав которой был взят из литературных источников. Дальнейшее определение наиболее эффективного состава питательной среды для глубинного культивирования Bacillus mojavensis Х2 проводили по результатам реализации метода аддитивно-решетчатого математического описания объекта.

Для получения аддитивно-решетчатого описания использовали ортогональные многоуровневые планы, в которых каждый уровень каждого фактора сочетается одинаковое число раз со всеми уровнями всех остальных факторов. Факторами, наиболее влияющими на биосинтез фермента L-арабинозоизомераза культурой Bacillus mojavensis Х2, являются следующие компоненты питательной среды: L-арабиноза, пептон, дрожжевой экстракт, (NH4)2SO4, K2HPO4, MgSO4*7H2O. Максимальный результат по активности L-арабинозоизомеразы Bacillus mojavensis Х2 среди проведенной серии опытов 39,68 ед.АиС/г был получен для следующего состава питательной среды (%): L-арабиноза – 0,5, пептон - 0,50, дрожжевой экстракт – 0,3, (NH4)2SO4 – 0,02, K2HPO4 – 0,5, MgSO4*7H2O - 0,02 (среда «Б»).

3.2.4. Интенсификации биосинтеза фермента L-арабинозоизомераза бактериями Bacillus mojavensis Х2 путем совершенствования состава питательной среды по содержанию источника углерода

В связи с тем, что фермент L-арабинозоизомераза является индуцибельным и для его биосинтеза необходимо присутствие в питательной среде моносахарида L-арабинозы в качестве единственного источника углерода, были проведены исследования по влиянию концентрации L-арабинозы в питательной среде на накопление биомассы Bacillus mojavensis Х2 и биосинтез внутриклеточного фермента L-арабинозоизомеразы. Концентрацию L-арабинозы в питательной среде изменяли от 0,5 до 2,0%. Результаты показали, что наибольший выход биомассы 6,85 г/дм3 и высокий выход активности L-арабинозоизомеразы 45,01 ед.АиС/г может быть достигнут при увеличении концентрации L-арабинозы в питательной среде до 1,5% (среда «В»).

3.2.5. Изучение динамики биосинтеза фермента L-арабинозоизомеразы культурой Bacillus mojavensis Х2 на питательной среде улучшенного состава

Результаты исследований по изучению влияния продолжительности культивирования на накопление биомассы Bacillus mojavensis Х2 и на биосинтез фермента L-арабинозоизомеразы представлены на рис. 2.

Рис.2. Динамика роста культуры и биосинтеза фермента L-арабинозоизомеразы

Из данных, представленных на рис. 2 видно, что прирост биомассы и увеличение активности внутриклеточного фермента L-арабинозоизомеразы наблюдается в течение 36 ч культивирования. Далее активность фермента падает, что, возможно, является следствием ингибирования L-арабинозоизомеразы продуктами метаболизма. В результате проведенных исследований установлено, что культивирование Bacillus mojavensis Х2 на оптимизированной по составу питательной среде «В» целесообразно вести 36 ч при рН 6,8 т.к. к этому времени наблюдается максимум ферментативной активности.

3.2.6. Дезинтеграция биомассы Bacillus mojavensis Х2

Из литературных данных известно, что L-арабинозоизомераза является внутриклеточным ферментом, поэтому необходимо было подобрать наиболее эффективный метод дезинтеграции бактериальной биомассы. Так как эндоферменты обычно жестко связаны с субклеточными частицами и мембранами и образуют крупные агрегаты, полиферментные комплексы, выделение таких ферментов из клеточной биомассы невозможно без предварительного разрушения клеточных оболочек, а затем разрыва и фрагментации субклеточных частиц и мембраны, с которыми эти ферменты связаны.