Выделение продуцента альфа-специфичной циклодекстринглюканотрансферазы из природных источников и разработка технологии ферментного препарата на его основе

На правах рукописи

СТРОЕВА СВЕТЛАНА СЕРГЕЕВНА

ВЫДЕЛЕНИЕ ПРОДУЦЕНТА АЛЬФА-СПЕЦИФИЧНОЙ ЦИКЛОДЕКСТРИНГЛЮКАНОТРАНСФЕРАЗЫ ИЗ ПРИРОДНЫХ ИСТОЧНИКОВ И РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА НА ЕГО ОСНОВЕ

Специальность 05.18.10 - Технология чая, табака и биологически активных

веществ и субтропических культур

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва – 2006

Работа выполнена на кафедре «Биотехнология» Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский Государственный Университет пищевых производств»

Научный руководитель:	доктор технических наук, профессор Иванова Людмила Афанасьевна
Официальные оппоненты:	доктор технических наук, профессор Кривова Анна Юрьевна кандидат технических наук, доцент Чурмасова Людмила Алексеевна

Ведущая организация: Общество с ограниченной ответственностью «Биофлора»

Защита состоится: « 07 » декабря 2006 г. в 10.00 час. в ауд. III-101 на заседании диссертационного совета Д.212.148.04 при ГОУ ВПО «Московский Государственный Университет пищевых производств» по адресу: 125080, Москва, Волоколамское шоссе, д. 11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО МГУПП.

Отзыв на автореферат в двух экземплярах, заверенный печатью учреждения, просим направлять по адресу: 125080, Москва, Волоколамское шоссе, д. 11, МГУПП, ученому секретарю диссертационного совета Д.212.148.04.

Автореферат разослан « 03 » ноября 2006 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, д.т.н., проф. Крюкова Е. В.

1. Общая характеристика работы.

Актуальность темы. Циклодекстринглюканотрансфераза (ЦГТ – аза, 1,4- альфа- D – глюкан- 4- альфа (1,4- альфа - глюкано) – трансфераза, К.Ф. 2.4.1.19) – фермент микробного происхождения, при воздействии которого на крахмал и аналогичные субстраты образуются циклические нередуцирующие декстрины различных размеров. В зависимости от количества альфа - D- глюкопиранозных остатков (6, 7 и 8), циклодекстрины обозначаются соответственно как альфа -, бета - и гамма - циклодекстрины (ЦД).

Синтезируемые ЦГТ – азами ЦД, вследствие уникального строения (гидрофильная поверхность и гидрофобная внутримолекулярная полость), способны образовывать комплексы – включения с различными органическими и неорганическими молекулами, изменяя их физико-химические свойства, за счет чего можно достичь таких эффектов, как увеличение в десятки и сотни раз растворимости в воде неполярных соединений, увеличение стабильности различных веществ к воздействию кислорода, воздуха, света, температуры. Благодаря этому ЦД широко используются в медицинской, фармацевтической, косметической, пищевой промышленности, сельском хозяйстве и других областях.

В промышленных масштабах ЦД можно получать лишь ферментативным путем, так как синтез этих соединений химическими методами очень дорог. В целом процесс получения ЦД сводится к следующим основным этапам: 1) культивирование микроорганизма – продуцента ЦГТ – аз, 2) выделение ферментного препарата из культуральной жидкости, 3) получение ЦД с помощью препарата ЦГТ–аз. В настоящее время выпуском ЦД заняты фирмы в различных странах мира. Стоимость бета - ЦД, промышленного производства, достигает 25 долларов США за килограмм, альфа - и гамма- ЦД имеют себестоимость в десятки раз более высокую.

Биохимические реакции, катализируемые ЦГТ – азами, очень сложны. При гидролизе субстрата (крахмала) с помощью ЦГТ – аз, может образовываться смесь альфа -, бета - и гамма - ЦД, линейных и разветвленных ЦД, моно –, ди – и три – сахаридов. В соответствии с преобладанием определенного вида ЦД в реакционной смеси ЦГТ – азы подразделяют на альфа -, бета - и гамма - специфичные.

В настоящее время в России производство ЦГТ-аз и ЦД отсутствует. В 80-е годы прошлого века в МГУПП под руководством профессора И.М.Грачевой были разработаны основы лабораторного культивирования продуцентов ЦГТ-аз. В связи с изменениями социального, политического и экономического характера в начале 90-х годов эти исследования были приостановлены. Однако во всех высокоразвитых странах интерес к комплексам включений на основе ЦД только возрастает. Поэтому разработка новых научно-обоснованных биотехнологий производства ЦГТ-аз и ЦД актуальна и перспективна.

Цель и задачи исследования. Основная цель диссертационной работы состояла в поиске активного продуцента альфа-ЦГТ-азы, оптимизации условий его культивирования для биосинтеза фермента и в получении очищенного ферментного препарата альфа-ЦГТ-зы Г10Х.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

• скрининг микроорганизмов-продуцентов ЦГТ-аз, выделенных из природных мест обитания, и коллекционных культур, с целью отбора штамма, обладающего преимущественно альфа-ЦГТ-азной активностью;
• идентификация штамма-продуцента альфа-ЦГТ-азы на основании изучения совокупности его морфологических, культуральных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик;
• подбор оптимального состава питательной среды и условий культивирования на основе изучения физиолого-биохимических особенностей штамма-продуцента;
• установление влияния микроэлементов и стимулятора роста микроорганизмов Гипоксена на накопление и активность альфа-ЦГТ-азы штамма-продуцента;
• разработка технологии получения ферментного препарата альфа-ЦГТ-азы Г10Х.

Работа выполнялась в рамках государственного контракта с Федеральным Агентством по науке и инновациям от 28 марта 2005 г № 02.434.11.3007 по теме: ЖС-12.4/004 «Ферментные системы и технологии получения цикло­декстринов».

Научная новизна работы. На основе анализа экспериментальных данных и выявленных зависимостей накопления бациллярным штаммом альфа-ЦГТ-азной активности от условий культивирования и выхода фермента, от параметров выделения и очистки, разработана биотехнология ферментного препарата альфа-ЦГТ-зы. Для создания основ биотехнологии альфа-ЦГТ-зы было произведено следующее:

• Проведен экспресс-скрининг микроорганизмов, выделенных из различных видов почв и коллекций культур. Получен новый штамм-продуцент с высокой альфа-ЦГТ-азной активностью, одним из уникальных свойств которого является устойчивость к высоким концентрациям солей натрия.

• На основании изучения совокупности морфологических, культуральных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик исследуемой культуры, новый галофильный штамм, продуцирующий альфа-ЦГТ-азу, идентифицирован как Paenibacillus macerans 1АМБ.

• В результате изучения физиолого-биохимических особенностей нового продуцента подобраны: оптимальный состав питательной среды и условия культивирования.

• Установлено влияние микроэлементов и стимулятора роста полифенольной природы Гипоксена на накопление и активность альфа-ЦГТ-азы штамма Paenibacillus macerans 1АМБ, определены параметры его внесения в процессе культивирования.

• На основании выявленных зависимостей накопления альфа-ЦГТ-азы в культуральной жидкости Paenibacillus macerans от условий культивирования и сохранения ее активности при концентрировании и очистке разработана технологическая схема получения ферментного препарата альфа-ЦГТ-азы Г10Х.

Практическая значимость и реализация результатов работы.

В результате скрининга почвенных ЦГТ-активных изолятов бактерий создана лабораторная коллекция микроорганизмов, секретирующих альфа-специфичные ЦГТ-азы. На основе наиболее перспективного штамма коллекции Paenibacillus macerans 1АМБ разработана биотехнология получения препарата альфа-ЦГТ-азы Г10Х. Разработаны паспорт штамма Paenibacillus macerans 1АМБ и Технические условия на ферментный препарат альфа-циклодекстринглюканотрансфераза Г10Х. С учетом выявленных в лабораторных исследованиях зависимостей выхода ЦГТ-азы от условий выделения, концентрирования и сушки, разработан Лабораторный регламент по производству ферментного препарата альфа-циклодекстринглюканотрансферазы Г10Х. Проведена наработка препаратов альфа- ЦГТ-азы различных степеней очистки (Г3Х, Г10Х) в условиях опытного производства. Полученные результаты подтверждены актом ОАО “Биохиммаш”. Изучены термо- и рН стабильность экспериментальных партий препарата альфа- ЦГТ-азы, показавшие перспективность его использования для получения ЦД.

Подана заявка на выдачу патента РФ на штамм бактерий Paenibacillus macerans 1 АМБ – продуцент альфа-ЦГТ-зы.

Апробация работы. Основные положения работы докладывались на Российских и международных конференциях и симпозиумах: Всероссийской научно-технической выставке-конференции «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» (Москва 2005); На Третьем международном симпозиуме «Микробные биокатализаторы и перспективы развития ферментных технологий в перерабатывающих отраслях АПК» (Москва 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, подана 1 заявка на патент РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, включающего 205 источников, и 7 приложений. Работа изложена на 200 страницах машинописного текста, включает 39 таблиц и 16 рисунков.

2. Обзор литературы

В литературном обзоре рассмотрено общее состояние проблемы создания производств ЦД и ЦГТ-аз в России. Приведены строение, свойства циклодекстринов и циклодекстринглюканотрансфераз и перспективы их практического использования в пищевой, фармацевтической промышленности, биотехнологии, химии, медицине и сельском хозяйстве. Описаны реакции, катализируемые ЦГТ-азами, основные продуценты данных ферментов, принципы выбора продуктивных штаммов для процессов получения ЦГТ-аз и влияние условий культивирования на биосинтез ЦГТ-аз различными микроорганизмами. Рассмотрены способы получения ЦД с помощью ЦГТ-аз.

Анализ данных литературы выявил проблемы, существующие в данной области, и позволил сформулировать цель и задачи настоящего исследования.

3. Экспериментальная часть
   1. Материалы и методы исследований

Микроорганизмы. В работе была использована лабораторная коллекция продуцентов ЦГТ-аз, выделенных из природных мест обитания сотрудниками кафедры “Биотехнология” Московского Государственного Университета пищевых производств и Института биологии Уфимского научного центра РАН, а также типовые культуры рода Bacillus и Micrococcus из коллекции кафедры “Биотехнология” Московского Государственного Университета пищевых производств и из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика.

Образцы почвы для скрининга. В качестве природных источников изолятов бактерий в настоящей работе использовали образцы почв Московской, Волгоградской, Воронежской и других областей России, ближнего и дальнего зарубежья. С момента отбора материал хранили при температуре (+2) – (+7)0С в течение 1-3 месяцев.

Скрининг ЦГТ-активных микроорганизмов из природных мест обитания и из коллекции культур МГУПП. Экспресс-скрининг микроорганизмов - продуцентов ЦГТ-аз, выделенных из природных мест обитания, проводили согласно схеме, разработанной сотрудниками Института биологии Уфимского научного центра РАН, с введением некоторых модификаций (Терехова Е. Я., 1999).

Питательные среды.

Среды для хранения и поддержания штаммов. Микроорганизмы из коллекции культур МГУПП хранили в пробирках при температуре 4°С на различных агаризованных средах: мясопептонный агар (МПА), питательная среда ГРМ для выращивания бактерий (на основе гидролизата рыбной муки), картофельный агар. Штаммы микроорганизмов, выделенные из почв, хранили на среде «В» следующего состава, г/дм3 : глюкоза – 1, пептон – 1, MgSO4 – 0,4, KH2PO4 – 0,4, агар – 2, pH среды после стерилизации – 7,2 – 7,4.

Среды, используемые при проведении скрининга. Среда «А», г/дм3: крахмал – 10; пептон – 3; дрожжевой экстракт – 3; кукурузный экстракт – 3; агар – 18; Na2HPO4 – 2; KH2PO4 – 2; pH сред после стерилизации – 7,4 – 7,6. Среда «Б», г/дм3: крахмал – 10; пептон – 3; дрожжевой экстракт – 3; кукурузный экстракт – 3; CaCO3 – 5; pH сред после стерилизации – 7,4 – 7,6.

Среды, используемые для проведения идентификации бактерий. Для идентификации бактерий использовали питательные среды производства ФГУП ГНЦ ПМ, п. Оболенск.

Морфология клетки. Морфологию, подвижность и размеры клеток исследовали с помощью фазовой оптической микроскопии на микроскопах МИКМЕД 5, БИОЛАМ И.

Фенотипическая характеристика. Изучение морфологических и физиолого-биохимических характеристик выделенных культур проводили, руководствуясь общей стратегией фенотипической дифференциации, описанной в руководствах: «Определитель бактерий» (Bergey’s manual, 1997), «Методы общей бактериологии (Герхард, 1983).

Определение последовательностей гена 16S pРНК.

Последовательности 16S pРНК генов были получены методом ПЦР. ПЦР проводилась на ДНК-амплификаторе GeneAmp PCR System 2700 фирмы Applied Biosystem в Центре “Биоинженерия” РАН.

Качественное определение альфа-ЦГТ-азной активности штаммов продуцентов, выращенных на тест-средах проводили модифицированным методом Тильдена-Хадсона (Tilden E.B., Hudson C.S., 1942; Терехова Е. Я., 1999).

Количественный метод определения активности альфа-ЦГТ-азы проводили по методу методу Мякеля-Лааксо (M. J. Makela, S.V. Laakso, 1988).

Измерение активности бета-ЦГТ-азы.

Измерение активности бета-специфичной ЦГТ-азы проводили спектрофотометрически – модифицированным фенолфталеиновым методом (Терехова Е. Я., 1999).

ВЭЖХ - анализ продуктов ферментативной конверсии крахмалов проводили на колонке «SEPARON-NH2» (размер – 4,6х250 мм, скорость подачи элюента 0,8 см3/мин, элюент – 60% водный ацетонитрил) в Центре “Биоинженерия” РАН.

Декстринирующую активность ЦГТ-азы определяли модифицированным методом Фува, основанным на измерении падения поглощения при определенной длине волны, связанного с изменением окраски йодного комплекса с крахмалом после окончания ферментативной реакции (Nakamura N., Horikoshi K., 1976).

Статистическую обработку экспериментальных данных, полученных не менее, чем в 3-х повторностях, проводили по программе Excel 2003 Microsoft Office.

Результаты исследований и их обсуждение

3.2.1. Скрининг ЦГТ-активных микроорганизмов из природных мест обитания и из коллекции культур МГУПП

Для получения высокоактивного продуцента альфа-ЦГТ-азы из 150 образцов почвы, отобранных из различных мест обитания (Европейская часть России, Крым, Израиль, Турция, Египет и др.) выделены 120 изолятов, осуществляющих деструкцию крахмала. Каждый изолят был подвергнут анализу на специфичность с помощью модифицированного теста Тильдена – Хадсона. Анализ показал, что 10 штаммов оказались бета - ЦГТ-активными, 15 штаммов альфа -ЦГТ-активными и 12 штаммов обладают смешанной альфа+ бета – специфичностью.

С целью выбора активных продуцентов ЦГТ-аз из коллекции кафедры “Биотехнология”, было проверено 55 культур из рода Bacillus и рода Micrococcus. Для обнаружения ЦГТ-азной активности культуральную жидкость исследуемых культур подвергали модифицированному тесту Тильдена – Хадсона и по характеру кристаллообразования судили о специфичности исследуемых культур. Анализ показал, что 10 штаммов оказались бета-ЦГТ-активными, 3 штамма альфа-??ЦГТ-активными и 2 штамма обладают смешанной альфа-?+ бета - специфичностью.

Таким образом, в результате проведенного скрининга для дальнейших исследований отобрано 18 штаммов микроорганизмов, секретирующих преимущественно альфа-ЦГТ-азу. С целью выбора наиболее активного продуцента все альфа – специфичные штаммы выращивали на среде состава “Б” с определением декстринирующей и альфа- и бета-циклизующей активностей по окончании культивирования. Культивирование осуществляли в течение 72 ч при 30 ±1С в колбах объемом 750 см3 со 100 см3 питательной среды на качалочной установке при n=180 об/мин.

Результаты определения декстринирующей и альфа- и бета-циклизующей активностей ЦГТ-азы в культуральных жидкостях испытанных бактериальных культур представлены в таблице 1.

Таблица 1

Декстринирующая и альфа- и бета-циклизующие активности бактериальных культур при глубинном выращивании в колбах на качалочной установке