Разработка биотехнологии препарата регулятора роста сельскохозяйственных растений на основе синтеза биологически активных веществ микромицетом phialocephala fortinii

На правах рукописи

СИНЧУРИНА ЕКАТЕРИНА ВЛАДИМИРОВНА

РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИИ ПРЕПАРАТА

РЕГУЛЯТОРА РОСТА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ НА ОСНОВЕ СИНТЕЗА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

МИКРОМИЦЕТОМ Phialocephala fortinii

Специальность: 05.18.07

– Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата технических наук

Москва – 2011

Работа выполнена на кафедре «Биотехнология» федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет пищевых производств» и в лаборатории отдела технологий препаратов на основе бактериальных и грибных культур Института прикладной биохимии и машиностроения ОАО «Биохиммаш»

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор

Иванова Людмила Афанасьевна

Официальные оппоненты: доктор технических наук

Храмов Евгений Николаевич

кандидат технических наук, доцент

Чекасина Елизавета Васильевна

Ведущая организация: Российский государственный аграрный университет – МСХА имени К.А. Тимирязева (РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева)

Защита состоится: «_____»__________2011 г. в ______час. в ауд. _____ на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.148.04 при ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств» по адресу: 125080, г. Москва, Волоколамское шоссе, д.11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГУПП.

Автореферат отправлен по адресу referat_vak@mon.gov.ru для размещения в сети Интернет Министерством образования и науки РФ и размещен на сайте www.mgupp.ru.

Отзыв на автореферат в двух экземплярах, заверенный печатью учреждения, просим направлять по адресу: 125080, г. Москва, Волоколамское шоссе, д. 11, МГУПП, ученому секретарю диссертационного совета Д 212.148.04.

Автореферат разослан «_____»______________2011 г.

Ученый секретарь совета, к.т.н. Тимофеев Д.В.

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Внедрение экологически безопасных и экономически выгодных технологий пищевого растениеводства является приоритетным направлением в решении проблемы обеспеченности пищевыми ресурсами народонаселения нашей страны. Разработанная национальная программа Государственной политики РФ в области сельского хозяйства на 2015 г, меняется в сторону его экологизации и стимулирования биодинамических и органических систем земледелия.

Альтернативой существующим («химическим») технологиям растениеводства призваны служить новые препараты - регуляторы роста растений (РРР) на биологической основе, позволяющих эффективно реализовать потенциальные возможности сорта или гибрида растений, заложенные в геноме. Они используют естественные механизмы взаимовыгодных симбиотических отношений растения и микромира, в котором оно существует. В настоящее время на Российском рынке РРР доля таких препаратов невелика: в Государственном каталоге пестицидов и агрохимикатов, разрешенных для применения на территории РФ (2011 г.), зарегистрированы только четыре отечественных препарата. Эти препараты разработаны на основе продуктов метаболизма микроорганизмов, они производятся по заказу потребителей и отсутствуют в свободной продаже. Поэтому разработка новой, интенсивной и научно-обоснованной биотехнологии производства регуляторов роста в количествах, способных обеспечить их широкое внедрение в практику пищевого растениеводства, актуальна и способна открыть широкие перспективы для получения экологически чистых продуктов питания.

Цель исследования.

1. Выделить и охарактеризовать новые микромицеты - симбионты растений, обладающих высокой ростостимулирующей активностью.

2. Разработать технологию культивирования активного микромицета - симбионта и получения на его основе препарата - РРР, пригодного для широкого практического применения в сельском хозяйстве.

3. Провести испытания препарата в лабораторных и мелкоделяночных условиях.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Проведение скрининга высокоактивных неспорообразующих штаммов микромицетов – симбионтов растений по биологической активности (БА), исследование их морфологических особенностей и физиологических потребностей;

2. Идентификация штамма-продуцента на основе анализа последовательности 18S rRNA;

3. Выявление основных закономерностей кинетики роста микромицета, оптимизация технологических параметров выращивания по методу глубинного культивирования;

4. Масштабный переход процесса культивирования от колб до аппарата большего типоразмера - ферментера;

5. Изучение химического состава препарата;

6. Разработка препаративной формы препарата с целью получения коммерческого продукта с длительным сроком хранения;

7. Проведение лабораторных, мелкоделяночных испытаний препарата и разработка рекомендаций по способам применения.

Работа выполнялась при финансовой поддержке фонда DOE IPP PNNL (№ 325771-А-G2).

Научная новизна работы. Получен новый штамм микромицета, комплекс метаболитов которого оказывает выраженное стимулирующее действие на рост и развитие растений. Определена видовая принадлежность микромицета, который отнесен к Phialocephala fortinii F-833.

На основании выявленных зависимостей биологической активности штамма от условий культивирования определен состав питательной среды и условия культивирования, обеспечивающие высокую активность комплекса его метаболитов. Разработан состав препаративной формы, подобран наполнитель, определены условия сублимационного высушивания.

Впервые выявлены наиболее эффективные условия выращивания штамма Phialocephala fortinii F-833 в лабораторном ферментере вместимостью 5 дм3 и в промышленных условиях в аппарате вместимостью 250 дм3.

Показано, что разработанный РРР обладает широким спектром действия – способствует ускорению процессов прорастания семян широкого ряда культур, значительно повышает параметры роста, развития, продуктивность, адаптивный потенциал. Полученная продукция отличается повышенным качеством.

Практическая значимость и реализация результатов работы. Создана лабораторная коллекция микроорганизмов, продукты метаболизма которых оказывают рострегулирующее действие на растения. Разработан паспорт на штамм Phialocephala fortinii F-833. Получен патент на изобретение №2237088 «Штамм продуцент комплекса биологически активных веществ, обладающих рострегуляторными свойствами». Штамм Phialocephala fortinii F-833 принят на национальное патентное депонирование в ГосНИИгенетика и включен в состав ВКПМ. Исследована патогенность штамма, получено заключение о возможности его использования при производстве биостимулятора роста растений.

Впервые разработана технология культивирования штамма Phialocephala fortinii F-833, как продуцента РРР в лабораторном ферментере и в промышленном аппарате. Проведено 20 ферментаций в аппарате вместимостью 5 дм3 и две ферментации в аппарате вместимостью 250 дм3. Разработаны ТУ оп 9291-008-04777441-2008 на препарат «Мицефит» регулятор роста растений, промышленный регламент на производство препарата «Мицефит» ПР-9291008-04777441-2008. Определены режимы сублимационного высушивания и состав препаративной формы, позволяющие сохранить качество препарата при хранении в широком диапазоне температур без потери активности. Разработана инструкция по способам применения препарата.

На разработанный препарат получено свидетельство на товарный знак № 260587 «Мицефит».

Наработаны опытные партии и проведены испытания препарата в лабораторных, мелкоделяночных, полевых условиях на производственных базах организаций, допущенных к проведению регистрационных испытаний Минсельхозом и ответственных за подготовку экспертных заключений для получения разрешения применения препарата в сельском хозяйстве.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались на Международных форумах, конгрессах и конференциях: «Биотехнология и современность» (С.-Пб.: 2006 г.); «Грибы и водоросли в биоценозах» (М.: 2006 г.); «Аэрокосмический Конгресс IAC» (М., 2006 г.); «Пилотируемые полеты в космос» (М., 2005 г.).

Препарат «Мицефит» представлялся на международных выставках: «Вэйстэк-2007» (М., 2007 г.), «Мир биотехнологии» (М., 2005-2007 гг.).

Научные положения, выносимые на защиту:

- научно-обоснованная технология получения препарата РРР на основе культуры микромицета, выделенного из ризосферы корней растений, для повышения безопасности пищевого растениеводства;

- выявленные в результате исследований основные параметры культивирования микромицета, обеспечивающие высокую эффективность биотехнологического производства нового препарата РРР.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Диссертационное исследование соответствует пп. 6, 13 и 14 паспорта специальности 05.18.07 – «Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ».

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 20 работ, в т.ч. 2 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК, 2 статьи в сборниках научных трудов, 16 статей в материалах международных научно-практических конференций, форумов, съездов, конгрессов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, включающего 210 источников, из них 77 иностранных, и приложений. Работа изложена на 219 страницах машинописного текста, включающего 34 рисунка и 39 таблиц.

1. Обзор литературы. В литературном обзоре рассмотрено общее состояние вопроса взаимоотношений растений и микромира, взаимовыгодные формы их взаимодействия в процессе вегетации. Рассмотрено современное состояние, практическое применение в растениеводстве регуляторов роста на основе микробиологического синтеза. Описаны методы глубинного культивирования микромицетов в ферментерах, рассмотрены вопросы масштабирования. Представлен обзор рынка препаратов регуляторов роста растений, разрешенных к применению на территории РФ. Рассмотрен вопрос безопасности пищевого сырья, обработанного РРР.

2. Экспериментальная часть
   0. 2.1. Материалы и методы исследований

Микроорганизмы. Объектами исследования являлись грибные культуры, выделенные из ризосферы корней растений. Ареалы обитания растительных организмов – Московская область и Центрально-черноземный район России. Отбор микромицетов проводили по способности выделенных моноизолятов синтезировать биологически активные вещества, оказывающие ростостимулирующее действие на растительные организмы. В работе было исследовано 100 культур микромицетов.

Выделение грибных культур. Корни растений отделяли, многократно отмывали водопроводной водой, затем обрабатывали 33% пероксидом водорода и 96% этанолом. Полученные образцы корней промывали водой, измельчали стерильными ножницами, помещали на плотную и жидкую питательную среду Гельцер с добавлением антибиотика стрептомицина (200 мкг/см3) и инкубировали в течение четырех недель [Гельцер Ф.Ю. 1990г]. Чистые культуры выделяли методом последовательных пересевов на агаризованную среду Гельцер с антибиотиком.

Скрининг культур. БА продуктов метаболизма изучаемых микромицетов оценивали с использованием гипокотильного биотеста на проростках горчицы сарептской и путём учета прироста корней и листьев у проростков злаковых трав [Нетрусов А.И, 2005].

Морфология клетки, фенотипическая характеристика. Морфологию и размер клетки исследовали с помощью светлопольной микроскопии живых и окрашенных мазков на микроскопе Jenamed. Изучение морфологических и физиолого – биохимических характеристик проводили, руководствуясь общей стратегией фенотипической дифференциации, описанной в руководствах: «Систематика грибов»[Черепанова Н.П., 2005г.], «Основы микологии» [Гарибова Л.В., 2005г.], «Микология сегодня» [Дьяков Ю.Т., 2007г.], «Симбиоз с микроорганизмами - основа жизни растений» [Гельцер Ф.Ю. 1990 г].

Определение последовательности 18S рРНК. Последовательности 18S рРНК генов были получены методом ПЦР в ВКПМ ФГУПГосНИИГенетика. Секвенирование проводилось на автосеквенаторе АЕ3000, для анализа секвенсов использовали специализированные программы:Blast, PDP 2.

Питательные среды. Культуры микромицетов хранили в пробирках при температуре (4±2)0С на плотной питательной среде Гельцер следующего состава, г/дм3: глюкоза – 8; К2НРО4 – 0,6; КН2РО4 – 1,8; МgSO4 – 0,2; K2SO4 - 0,1; аспарагин – 0,02; раствор микроэлементов – 1 см3; агар микробиологический – 20; рН 6,5±0,2. Штаммы поддерживали путём последовательных пересевов один раз в два месяца.

Культивирование. Культивирование проводили при рН 5,5-6,0; температуре (26±1)оС в течение 21 суток.

Глубинное культивирование осуществляли: в конических колбах вместимостью 250 см3 с объёмом заполнения питательной средой (ПС) 100 см3 на качалке с частотой вращения платформы 200 об/мин и в ферментерах вместимостью 5 дм3 фирмы LKB (Швеция), с рабочим объемом 3 дм3 и фирмы Бион (Россия) вместимостью 250 дм3, с рабочим объемом 100 дм3. Условия перемешивания и аэрации в ферментере составляли 150 об/мин и расходе воздуха, подаваемого на аэрацию, 0,5 дм3 на 1 дм3 ПС.

Концентрацию биомассы определяли весовым способом в трех повторностях по воздушно сухой массе (ВСМ) [Нетрусова А.И., 2005]. Редуцирующие вещества (РВ) в фильтрате определяли методом Бертрана [Грачева И.М., 1971г]. Объемный коэффициент массопередачи кислорода KLa определяли сульфитным методом [Перт С.Д., 1978 г].

Определение химического состава. Определение фитогормонов, свободных аминокислот, сахаров проводили в РГАУ-МСХА им.К.А.Тимирязева.

Экстракция, очистка фитогормонов [индолилуксусная (ИУК), абсцизовая (АБК) кислоты, цитокинины (ЦК), гиббереллины (ГА)] выполнялась по методике РГАУ-МСХА им. К.А.Тимирязева [Скоробогатова И.В., 1999 г]. ЦК, ИУК, АБК определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Количественное содержание ГА определяли по калибровочной кривой, для построения которой использовали гибберелловую кислоту (Россия). БА бесклеточного фильтрата определяли по методу Франкленда и Уоринга с использованием салата сорта Берлинский [Скоробогатова И. В.,1999 г; Нетрусов А.И., 2005 г].

Содержание свободных углеводов, аминокислот проводили методом ионообменной хроматографии на анализаторе Hitachi-835 (Vratny P., 1980).

Наличие жирных кислот определяли в Военной Академии РХБЗ методом ВЭЖХ. Исследование элементного состава проводили там же методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ICP-MS) на спектрометре ED2000 «Oxford Instruments».

Статистическую обработку экспериментальных данных, полученных не менее, чем в 3-х повторностях, проводили в Microsoft Office Exel.

2.2. Результаты исследований и их обсуждение

2.2.1. Скрининг микромицетов. Всего было выделено 100 грибных изолятов из образцов 30 растений. На основании изучения макро- и микроморфологических особенностей выделенных микоризных грибов для дальнейшей работы были отобраны 33 моноизолята, которые в цикле своего развития при росте на плотной ПС Гельцер не образовывали спор.

2.2.2. Сравнение биологической активности штаммов в условиях глубинной культуры. В климатической камере фитотрон определяли БА фильтрата культуральной жидкости (КЖ) каждого изолята. Установили, что семь штаммов микромицетов обладают высокой БА, в интервале разведений КЖ от 10-4 до 10-7 см3/см3 (см. рис. 1).

Максимальную БА показал штамм, выделенный из корней багульника болотного (Ledum palustre L.). Увеличение длины корней и стеблей растений мятлика составляло соответственно 97% и 22 % по сравнению с контролем.

	Основные морфологические и филогенетические особенности отобранного штамма. Микромицет из корней багульника аэроб; при росте на плотной питательной среде Гельцер гриб дает медленно растущие прижато - бархатистые колонии черного
Рис. 1. Биологическая активность микромицетов, выделенных из корней растений.

цвета ростовой коэффициент равен 10 (Бухало, 1988г.); окраска среды не изменяется. Гифы гриба (диаметр гиф не превышает 3 мкм) темно окрашены, с большим содержанием капель масла, на гифах формируется большое количество интеркалярных, собранных в цепочки шаровидных хламидоспор. Культура обладает протеолитической активностью и не обладает амилолитической и липолитической.

Идентификация штамма проводилось в ВКПМ ФГУП ГосНИИГенетика. По данным секвенса было построено филогенетическое дерево, где показано, что культура с точностью 97,3 % относится к роду Phialocephala виду fortinii F-833.

2.2.3. Определение биологической активности Phialocephala fortinii F-833 на зерновых сельскохозяйственных культурах в лабораторных условиях. Проведены испытания по обработке семян различных зерновых культур (пшеница, ячмень, просо, подсолнечник, мятлик, райграс) путём замачивания в фильтрате КЖ Phialocephala fortinii F-833 при разведении 10-5 см3/см3 (см. табл. 1). Контрольные варианты семян замачивали в стерильной водопроводной воде.

Таблица 1. Биологическая активность фильтрата культуральной жидкости гриба Phialocephala fortinii F-833 в % к контролю (контроль - вода, 100 %)

№ п/п	Культура*	Всхожесть	Биологическая активность, %
			Стебли	Корни
1	2	3	4	5
1.	Пшеница	103,4 ± 5,6	107,3 ± 3,4	144,1 ± 3,8
2.	Ячмень	130,0 ± 8,3	118,9 ± 9,1	125,4 ± 8,2
3.	Просо	128,2 ± 7,4	129,6 ± 7,8	110,9 ± 8,1
4.	Подсолнечник	100,0 ± 6,8	110,0 ± 8,1	106,1 ± 7,0
5.	Мятлик	128,2 ± 10,3	139,7 ± 9,8	137,4 ± 9,3
6.	Райграсс	112,0 ± 6,7	136,7 ± 5,4	138,9 ± 5,1