Создание и применение методов количественной протеомики с использованием и без использования изотопного мечения

Российская академия наук

Институт энергетических проблем химической физики

____________________________________________________________

На правах рукописи

АГРОН ИЛЬЯ АЛЕКСАНДРОВИЧ

Создание и применение методов количественной протеомики с использованием и без использования изотопного мечения

01.04.17 – химическая физика, горение и взрыв, физика экстремальных состояний вещества

автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата физико-математических наук

Москва, 2011г.

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте энергетических проблем химической физики РАН

Научный руководитель:

доктор физико-математических наук, профессор

Николаев Евгений Николаевич

Официальные оппоненты:

Доктор физико-математических наук, профессор

Барашев Петр Петрович

Доктор химических наук

Трофимов Алексей Владиславович

Ведущая организация:

Московский физико-технический институт (Государственный университет)

Защита состоится «26» октября 2011г. в 11 час. 00 мин. на заседании диссертационного совета Д 002.112.01 при Институте энергетических проблем химической физики Российской академии наук по адресу: 119334, г. Москва, Ленинский проспект, д. 38, корп.1, актовый зал ИХФ и ИНЭП ХФ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической физики им. Н.Н. Семенова Российской академии наук.

Автореферат разослан «24» сентября 2011г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д.002.112.01

кандидат физико-математических наук Ларичев М.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Введение и актуальность проблемы

При помощи современных методов, основанных на масс-спектрометрическом анализе, можно исследовать биологические объекты самого разного происхождения и сложности. Это стало возможным благодаря открытию новых методов ионизации вещества: метода электроспрей и метода лазерной десорбции/ионизации из матрицы (МАЛДИ) – которые позволили переводить в газовую фазу и одновременно ионизировать большие биологические молекулы, такие как пептиды, белки и полинуклеотиды. Среди методов масс-спектрометрии, используемых в протеомных исследованиях, масс–спектрометрия ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье (ИЦР ПФ) занимает особое место. Главными достоинствами этого метода являются: сверхвысокая разрешающая способность и рекордная точность измерения масс. С помощью современного масс-спектрометра ИЦР ПФ можно однозначно как идентифицировать индивидуальные биомолекулы, так и определять состав их смесей.

В настоящее время полностью расшифрованы геномы различных организмов, в том числе и человека. В связи с исследованиями многообразия белков, содержащихся в различных биологических объектах, возникла новая фундаментальная концепция, названная «протеом» (ПРОТЕиновое дополнение к генОМу). Создана новая дисциплина - протеомика, которая призвана дополнить и аннотировать информацию, содержащуюся в геномах. Современная масс-спектрометрия (в том числе, и ИЦР ПФ) занимает передовые позиции в решении основной задачи протеомики идентификация белков. В настоящее время также ведется активная разработка масс-спектрометрических методов количественного анализа протеомов.

Масс-спектрометр ИЦР ПФ обладает ограниченным динамическим диапозоном, в то же время, протеомы различных организмов содержат белки в широком диапазоне относительных концентраций. И поэтому необходимо использовать масс-спектрометрии ИЦР ПФ в комбинации с существующими методами разделения (жидкостная хроматография, электрофорез). Время удерживания пептида (продукта гидролиза белка энзимом трипсин) на хроматографе может являться дополнительным параметром при идентификации пептида.

В работе разрабатывались и оптимизировались методы, использующие масс-спектрометрию ИЦР ПФ для исследования протеомного состава одной из физиологических жидкостей человека – мочи. В работе были разработаны и использованы новые подходы для обработки и интерпретации полученных данных, в том числе, для сравнительного количественного анализа протеома. Также проводилась разработка подхода для совмещения методов атомно-силового микроскопа и масс-спектрометрии, где масс-спектрометрические методы использовались для идентификации молекул, обнаруживаемых АСМ.

Цели и задачи

1. разработать хромато-масс-спектрометрические методики анализа протеомного состава мочи человека;
2. разработать и применить в реальных исследованиях метод точной массово-временной метки для анализа протеома мочи;
3. создать новую базу данных, состоящую из точных массово-временных меток, для быстрого поиска и идентификации белков содержащихся в моче человека;
4. разработать методику сравнительного количественного анализа протеома, реального биологического объекта;
5. разработать подход масс-спектрометрической идентификации белков детектируемых методами атомно-силовой микроскопии.

Научная новизна работы

1. Cоздана база данных точных массово-временных меток триптических пептидов протеома мочи человека.
2. Cоздана новая процедура нормирования времен удерживания на колонке жидкофазного хроматографа триптических пептидов белков, содержащихся в моче человека, которая может быть использована для идентификации белков методом точных массово-временных меток.

3. Разработан новый метод для сравнительного количественного анализа на основе использования методов точной массово-временной метки и изотопного мечения с применением концепции гипотетической аминокислоты «аверагин» для коррекции значений интенсивности пиков пептидов в спектрах.

4. Исследован протеомный состав мочи здорового человека, при помощи новой хромато-масс-спектрометрической методики, основанной на методе точной массово-временной метки. Обнаружено 39 новых генных продуктов.

5. Предложен подход совместного использования методов атомно-силовой микроскопии и масс-спектрометрии для идентификации и количественного определения содержания белков при сверхмалых концентрациях.

Практическая значимость работы

Разработанные хромато-масс-спектрометрические подходы для качественного и количественного анализа биологических жидкостей человека могут быть использованы при разработке методов диагностики различных патологий, вызванных, в том числе, заболеваниями.

Новая база данных точных массово-временных меток может использоваться для высокопроизводительного анализа протеома мочи человека при поиске биомаркеров различных заболеваний.

Подход, разработанный для идентификации белков, детектируемых методами атомно-силовой микроскопии может применяться для исследования других объектов, содержащихся в сверхнизких концентрациях в реальных биологических жидкостях.

Личный вклад автора

Материал, представленный в диссертации, получен при непосредственном участии автора как в постановке задачи, так и при проведении исследований. База данных точных массово-временных меток создавалась автором совместно с Д.М. Автономовым (ИНЭП ХФ РАН), И.А. Поповым (ИБХФ РАН) и А.С. Кононихиным (ИНЭПХФ РАН). Метод количественного анализа был разработан автором совместно с Д.М. Автономовым (ИНЭП ХФ РАН). Подход к совместному использованию методов атомно-силовой микроскопии и масс-спектрометрии был разработан совместно с А.С. Батуриным, Е.В. Дедковой (МФТИ (ГУ)). Диссертационная работа выполнена в Институте энергетических проблем химической физики Российской академии наук, в Лаборатории ионной и молекулярной физики, часть работ выполнялась автором параллельно в Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук в период с 2005 по 2011 год.

Защищаемые положения

1. новая база данных точных массово-временных меток триптических пептидов протеома мочи;
2. новый метод количественного анализа протеома физиологических жидкости человека, основанный на использовании методик точной массово-временной метки и изотопного мечения триптических пептидов изотопом 18O;
3. новая процедура нормирования времен удерживания на хроматографической колонке и идентификации пептидов;
4. метод идентификации белков при сверхмалых концентрациях с использованием масс-спектрометрии и атомно-силовой микроскопии.

Апробация работы

Результаты работы докладывались на следующих российских и международных конференциях: 58-ая Ежегодная конференция американского масс-спектрометрического общества «Масс-спектрометрия и смежные темы», Солт Лейк Сити, США, 23-27 мая 2010; 4-я Всероссийская конференция «Фундаментальные вопросы масс-спектрометрии и ее аналитические применения», Звенигород, Россия, 10 -14 октября 2010; 8-ая Международная конференция организации “Протеом Человека” (HUPO), Торонто, Канада, 26-30 сентября 2009; 57-ая Ежегодная конференция американского масс-спектрометрического общества «Масс-спектрометрия и смежные темы», Филадельфия, США, июнь 2009.

Публикации

Основное содержание диссертации опубликовано в работах, список которых приводится в конце автореферата. Работы, результаты которых изложены в диссертации выполнены при поддержке грантов РФФИ, INTAS, Миннауки.

Структура и объем диссертации

Работа изложена на 87 страницах, содержит 19 рисунков и 2 таблицы. Диссертация состоит из четырех глав, заключения и списка цитируемой литературы.

Список сокращений, используемых в тексте автореферата

ИЦР ПФ – ионный циклотронный резонанс с преобразованием Фурье;

AMT – подход точной массово-временной метки (accurate mass and time tags database);

LC – высокоэффективная жидкофазная хроматография (liquid chromatography);

MS – масс-спектрометрия (mass-spectrometry);

MS/MS – тандемная масс-спектрометрия;

CID – столкновительно-индуцированная фрагментация (collision induced dissociation);

ECD – фрагментация при захвате медленнего электрона (electron capture dissociation);

IRMPD – инфракрасная мультифотонная диссоциация (infrared multi photon dissociation);

АСМ – атомно-силовая микроскопия.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Первая глава является литературным обзором, в котором дается краткое описание объекта исследования (моча человека), обсуждаются трудности и ограничения стандартных методов исследования протеома мочи (нисходящий и восходящий подходы протеомного анализа, подход точной массово-временной метки), обсуждаются возможности и преимущества применения масс-спектрометрии ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье (ИЦР ПФ) в комбинации с различными методами фрагментации и ионизации биомакромолекул, с высокоэффективной жидкостной хроматографией и новыми методами обработки масс-спектров ИЦР.

Однозназначная идентификация, как индивидуальных биомакромолекул, так и их смесей напрямую связана с точностью измерения масс, поэтому в обзоре особое внимание уделено обсуждению этой характеристики.

Точность измерения масс и разрешение в масс-спектрометрии ИЦР ПФ

Измеряемой величиной в масс-спектрометрии ИЦР ПФ является частота, по значению которой можно рассчитать массу иона используя общепринятое калибровочное выражение:

,

где m и z – масса и заряд иона, соответственно, - измеряемая частота. Коэфиценты А и В являются постоянными величинами и расчитываются при калибровке масс-спектрометра по двум или более известным массам. Выражение (1) получается в приближении одного иона и не учитывает влияние объемного заряда и кулон-кулоновского взаимодействия между ионами. На практике для более точных измерений используется внутренняя калибровка масс-спектрометра, когда в образце содержатся одновременно исследуемое вещество и калибрант, поскольку, ионы калибранта вместе с ионами исследуемого вещества, подвержены одинаковым эффектам, искажающим точность измерения масс. Также проводят точные измерения с использованием внешней калибровки, при этом калибрант вводят отдельно от исследуемого вещества, если для каждого измерения в ИЦР ячейку захватывается примерно одинаковое число ионов.

В работе все измерения производились на гибридном масс-спектрометре Finnigan LTQ FT (Thermo Electron, Бремен, Германия; Рис. 1), который состоит из масс-спектрометра ИЦР ПФ со сверхпроводящим соленоидом (7 Тесла) и высокочувствительной линейной квадрупольной ионной ловушки.

Рис. 1. Схема гибридного масс-спектрометра Finnigan LTQ FT.

Изображенный на Рис. 1 гибридный масс-спектрометр является одним из самых современных приборов в своем классе и позволяет проводить измерения в режиме ИЦР ПФ с максимальным разрешением R=500000 для m/z=400 и точностью измерения масс 2ppm (при использовании внешней калибровки). Главными достоинствами прибора являются автоматический контроль числа ионов в масс-анализаторе и возможность использовать современные методы ионизации (электроспрей, атмосферный МАЛДИ) и фрагментацию биомакромолекул (в линейной квадрупольной ионной ловушке реализована столкновительно индуцированная фрагментация (CID), в ячейке ИЦР - инфракрасная мультифотонная диссоциация (IRMPD) и диссоциация, происходящая при захвате медленных электронов (ECD)). Последний из перечисленных методов фрагментации в отличии от двух первых позволяет получить осколки пептидов, образованные не по пептидной связи, а по связи N-C(альфа), так называемые c-, z-фрагменты.

Масс-спектрометрия ионного циклотронного резонанса была выбрана по причине максимальной точности измерения масс (в сравнении с другими масс-спектрометрическими методами- времяпролетная масс-спектрометрия, ионная ловушка, Орбитрэп), и достаточно высокой скорости измерения спектров для совмещения с хроматографическим методом разделения триптических пептидов, что необходимо для работы с использованием метода точной массово-временной метки, который в свою очередь, позволяет добиться минимального времени проведения эксперимента, количества образца и понижения порога чувствительности (из-за отказа от MS/MS).

Количественные методы в протеомике глобально подразделяются на два типа: с применением и без применения изотопных меток.

Изотопные метки для попарного сравнения образцов (для задач протеомики) начали разрабатываться с самого начала применения в этой области тандемной хромато-масс-спектрометрии (LC-MS/MS). Метод основан на том, что в результате мечения пептиды в опытном и контрольном образцах дают пики в масс-спектрах, отстоящие друг от друга на несколько единиц массы. Метки конструируют таким образом, чтобы они не влияли на эффективность ионизации и времена хроматографического удерживания. По отношению интенсивностей пиков соответствующих пептидов определяют их относительное содержание в образцах.

Разработано несколько коммерчески доступных решений для проведения сравнительного количественного анализа протеомов. Примерами могут служить технологии ICAT (Isotope-Coded Affinity Tag) и ICROS (Isotope Coded Reduction Off of Chromatographic Support), в которых мечение производится по цистеиновому остатку. Более сложной является технология iTRAQ (Isobaric Tagging Reagents Amino-reactive Quantification), которая позволяет проводить количественный анализ сразу 4 образцов – но с использованием MS/MS. Изобарные (имеющие одинаковые массы) метки в iTRAQ связываются с N-концевым остатком пептидной цепи. Одним из методов модификации для количественного анализа является гуанидирование лизинового остатка пептидов.

Для сравнительного количественного анализа протеомов нами было использовано более простое и экономичное C-концевое ферментативное мечение изотопом кислорода 18О. Использование 18О-атома в качестве метки известно еще с работ Спирсона (Spirson) и Риттенберга (Rittenberg) 1951-го года, которые исследовали механизм ингибирования продуктов реакции гидролиза амидной связи химотрипсином. При применении 18О/16О изотопного мечения получаются химотриптические пептиды, меченые по С-концу независимо от их аминокислотной последовательности. Благодаря ряду преимуществ, таких как относительно несложная химия и сдвиг массы на строго определенную величину, 18О/16О изотопное мечение стало популярным методом в количественной протеомике. Однако из-за слишком малой разницы масс между изотопами (всего 2 или 4 Да) этот подход применяется только в сочетании с масс-спектрометрами сверхвысокого разрешения (R порядка 500000).

Также в первой главе приводится обзор литературы, посвященной методу атомно-силовой микроскопии и методикам совмещения АСМ и масс-спектрометрии для идентификации биомолекул. Описаны концентрационные критерии для возможности совмещения этих методов.

Во второй главе описывается хромато-масс-спектрометрическая методика, разработанная для анализа протеома мочи человека, процедура создания базы данных метода точных массово-временных меток, структура базы и методы поиска и идентификации белков, содержащихся в моче человека, с ее использованием.

Процедура анализа протеома мочи человека строилась на стандартном подходе, который используется в протеомике биологических жидкостей и состоящем из следующих этапов: (1) отбор пробы содержащей белки; (2) очистка, концентрирование и предварительное разделение смеси белков; (3) энзиматическое расщепление белков – получение смеси пептидов; (4) хромато-масс-спектрометрический анализ смеси пептидов; (5) поиск и идентификация белков.

Хромато-масс-спектрометрическая методика анализа смеси пептидов была разработана на базе нанопоточного высокоэффективного жидкостного хроматографа (нано-ВЭЖХ) Agilent 1100 (Agilent, США) и масс-спектрометра Finnigan LTQ FT (Thermo Electron, Бремен, Германия). Для соединения нано-ВЭЖХ с масс-спектрометром использовался наноспрейный ионный источник, который был разработан и собран в лаборатории.

Разделение смеси пептидов при помощи нано-ВЭЖХ проводилось методом градиентного элюирования – подвижная фаза В (80% ацетонитрил + 20% вода + 0,1% муравьиной кислоты) изменялась от 3% до 35% в течение 120 минут, скорость потока подвижной фазы была 0,3мкл/мин.

Масс-спектрометрический анализ фракций пептидов осуществлялся при помощи программы Xcalibur (Thermo Electron, Бремен, Германия) в двухстадийном режиме автоматического измерения спектров. На первой стадии в масс-спектрометре ИЦР ПФ измерялись точные массы пептидов в диапазоне m/z 300-1600, с разрешением R=25000 для m/z 400 (число ионов в ячейке ИЦР: 5*106). На второй стадии из ИЦР масс-спектра выбирались три максимальных пика, для которых производилась либо столкновительно индуцированная фрагментация (CID), либо фрагментация, при захвате медленных электронов (ECD). Фрагментация CID и измерение спектров CID фрагментов происходили в линейной квадрупольной ионной ловушке (число ионов: 3*104). Фрагментация ECD и измерение спектров ECD фрагментов осуществлялись в ИЦР-ячейке (число ионов: 5*105). В режиме автоматического двухстадийного анализа пептиды, для которых фрагментация уже была проведена, динамически исключались из исследования на 30 секунд.