Изучение метаболома листьев березы с целью создания лекарственного препарата

На правах рукописи

Раева Анастасия Анатольевна

ИЗУЧЕНИЕ МЕТАБОЛОМА ЛИСТЬЕВ БЕРЕЗЫ С ЦЕЛЬЮ СОЗДАНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА

14.04.01 – Технология получения лекарств

Автореферат

Диссертации на соискание ученой степени кандидата

фармацевтических наук

Москва 2010

Диссертационная работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН.

Научный руководитель:

Доктор фармацевтических наук, профессор

Демина Наталья Борисовна

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук, профессор	Л.П. Истранов
Кандидат фармацевтических наук, доцент	Л.А. Павлова

Ведущее учреждение: НИИ Фармакологии имени В.В. Закусова РАМН

Защита состоится «___»___________________ 2011 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 006.070.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН (117216, г. Москва, ул. Грина, 7) по адресу: 123056, г. Москва, ул. Красина, д.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЛАР по адресу: 117, г. Москва, ул. Грина, д.7.

Автореферат разослан «___»___________________ 2011 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 006.070.01

Доктор фармацевтических наук Громакова А.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Препараты растительного происхождения по сравнению с синтетическими лекарственными средствами обладают мягким терапевтическим действием и низкой токсичностью, вследствие чего могут применяться в течение длительного времени. Сложность и многообразие химического состава препаратов растительного происхождения обусловливает их широкий спектр действия на организм и способность комплексно влиять на различные звенья патологического процесса.

В настоящее время развитие новых инструментальных высокочувствительных методов анализа пробудило интерес ученых к более детальному изучению фитохимического состава хорошо известных и широко применяемых в медицине лекарственных растений для выделения новых биологически активных веществ.

Одним из перспективных видов сырья для разработки новых лекарственных препаратов является береза повислая (Betula pendula Rhoth), сем. Березовые (Betulaceae). Вместе с березой пушистой (Betula pubescens Ehrh) данный вид разрешен к медицинскому применению на территории Российской Федерации. Листья березы имеют богатый химический состав, что делает их ценным источником биологически активных веществ (БАВ). Наибольшее значение имеют фенольные соединения, главным образом, флавоноиды, обладающие противовоспалительной, антиоксидантной, спазмолитической и капилляроукрепляющей активностью. Препараты из листьев березы применяются официальной медициной в качестве мочегонного средства, но их фармакологическое действие на организм человека гораздо шире и в настоящее время активно исследуется. Так, в Университете г. Турку в Финляндии В.И. Осиповым и др. (2001 г.) из листьев березы горной (Betula pubescens ssp. czerepanovii) был получен сухой экстракт с содержанием проантоцианидинов около 20 %. Эти вещества обнаружены в листьях других видов березы (M. Karonen et al., 2006 г.). Проантоцианидины (конденсированные танины) - комплексные флавоноидные полимеры широко распространенные в растительном мире. Эти соединения проявляют антирадикальную активность и иммуномодулирующее действие, поэтому поиск их отечественных источников перспективен для дальнейшего создания препаратов, предупреждающих заболевания, связанные с дисбалансом окислительных процессов.

Во Всероссийском НИИ лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) на основе листьев березы (B. pendula Rhoth или B. pubescens Ehrh) разработан и производится сухой экстракт, обладающий умеренным желчегонным, мочегонным, спазмолитическим, противовоспалительным и антимикробным действием. Экстракт листьев березы входит в состав комплексного препарата растительного происхождения "Сибектан", но самостоятельно в качестве лекарственного препарата до настоящего времени не используется. Глубокое изучение состава экстракта с целью идентификации всего спектра биологически активных веществ позволит установить наличие в экстракте различных групп ценных БАВ, что представляет интерес для расширения спектра его возможного терапевтического действия и создания лекарственного препарата на его основе.

Полученные результаты покажут целесообразность оптимизации технологии получения сухого экстракта с целью обогащения продукта биологически активными веществами (флавоноидами и проантоцианидинами) и разработки твердых лекарственных препаратов на основе березы листьев экстракта сухого (БЛЭС).

Целью настоящей работы является изучение состава метаболитов и научно обоснованная разработка лекарственного препарата на основе БЛЭС, а также оптимизация технологии получения БЛЭС для повышения содержания в нем БАВ - флавоноидов и проантоцианидинов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• Провести детальное фитохимическое исследование БЛЭС с применением методов высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и газовой хроматографии с масс-спектрометрической детекцией (ГХ-МС);
• Разработать инструментальные методики количественного определения отдельных групп БАВ (флавоноидов и проантоцианидинов) в БЛЭС;
• Провести оптимизацию технологии экстракции листьев березы с целью получения продуктов, обогащенных проантоцианидинами и флавоноидами.
• Обосновать состав и разработать технологию получения твердой лекарственной формы БЛЭС для перорального применения;
• Определить показатели качества и установить нормы допустимых отклонений в процессе производства и хранения разработанного лекарственного препарата;
• На основе результатов исследований разработать проекты нормативно-технической документации (фармакопейной статьи предприятия (ФСП) и лабораторного регламента) на полученный лекарственный препарат “Экстракт березы листьев”, капсулы, 0,2.

Научная новизна:

С помощью современных инструментальных методов, таких как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и газовая хроматография с масс-спектрометрической детекцией (ГХ-МС), проведен детальный фитохимический анализ и установлен состав метаболитов БЛЭС. В экстракте присутствуют в большом количестве фенольные соединения, основными из которых являются флавоноиды, а также полярные и липофильные вещества нефенольной природы. Также в БЛЭС обнаружены проантоцианидины.

Разработаны методики стандартизации БЛЭС методом спектрофотометрии по сумме фенольных соединений в пересчете на гиперозид и по проантоцианидинам в пересчете на цианидин.

При производстве лекарственной формы, содержащей БЛЭС, - твердых желатиновых капсул - впервые разработан метод влагоактивизированной грануляции (ВАГ), позволяющий получить однородный по размеру частиц, хорошо сыпучий гранулят. Предложенный метод грануляции позволяет минимизировать количество гранулирующей жидкости (по сравнению с методом традиционной влажной грануляции) и исключить стадии термической сушки и последующей калибровки гранулята, что существенно сокращает время технологической переработки экстракта при гранулировании и снижает дестабилизирующее действие технологических факторов на экстракт.

На основании экспериментальных данных по изучению возможности обогащения продукта проантоцианидинами впервые предложена интенсивная технология процесса экстрагирования листьев березы, позволяющая увеличить выход целевых веществ - флавоноидов и проантоцианидинов - при одновременном существенном снижении времени экстракции в 3 раза.

Практическая значимость.

Разработана технология получения лекарственного препарата, содержащего БЛЭС, в виде твердых желатиновых капсул с применением ВАГ.

На основе проведенных комплексных лабораторных исследований разработана следующая нормативно-техническая документация:

• проект ФСП на лекарственный препарат “Экстракт березы листьев”, капсулы, 0,2;
• проект лабораторного регламента на лекарственный препарат “Экстракт березы листьев”, капсулы, 0,2;

Разработанный метод влагоактивизированной грануляции используется в учебном процессе на кафедре фармацевтической технологии фармацевтического факультета Первого МГМУ им. И.М. Сеченова, о чем свидетельствует акт внедрения результатов научных достижений в учебный процесс № 04/11 от 08.04.2011 г.

Основные положения, выдвигаемые на защиту.

• Результаты детального фитохимического исследования состава БЛЭС, проведенного методами ВЭЖХ и ГХ-МС;
• Методики и результаты стандартизации БЛЭС по сумме фенольных соединений в пересчете на гиперозид и по проантоцианидинам в пересчете на цианидин;
• Результаты исследований по оптимизации технологии получения БЛЭС для получения сухого экстракта березы листьев с повышенным содержанием флавоноидов и проантоцианидинов;
• Результаты исследований по разработке состава и технологии получения твердых желатиновых капсул БЛЭС;
• Методы анализа и результаты определения показателей качества для твердых желатиновых капсул БЛЭС в процессе производства и хранения.

Апробация работы.

Основные положения диссертации представлены на Межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых “Фармация в XXI веке: эстафета поколений в Санкт-Петербургской ХФА” (2009 г), VII Международном симпозиуме по фенольным соединениям (2009 г), X международном конгрессе “Здоровье и образование в XXI веке” “Инновационные технологии в биологии и медицине” (2009 г), 66-й региональной конференции по фармации и фармакологии (2011 г.).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 3 в печатных изданиях, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материалов и методов (глава 2), результатов собственных экспериментальных исследований (главы 3-5), общих выводов, списка литературы и приложения. Содержит 162 страницы печатного текста, 28 таблицу, 32 рисунка. Список использованной литературы включает 143 источника, в том числе 89 на иностранных языках.

В обзоре детально рассматриваются пути применения препаратов из листьев березы в медицине. Приведены результаты работ по изучению химического состава листьев березы, описана фармакологическая активность основных биологически активных веществ. Рассмотрены современные методы анализа биологически активных веществ, позволяющие определить метаболом лекарственного растительного сырья для последующего выделения обнаруженных полезных фармакологически активных компонентов. Изложены основные особенности производства твердых лекарственных форм на основе растительных экстрактов.

Глава 2 содержит характеристики использованных материалов и методики исследований (аналитические, физико-химические и технологические), указаны используемые в работе для обработки экспериментальных данных математико-статистические методы.

В главе 3 представлены собственные экспериментальные данные по определению фитохимического состава березы листьев сухого экстракта производства ВИЛАР с применением методов ВЭЖХ и ГХ-МС.

В главе 4 приведены результаты исследований по разработке методик стандартизации березы листьев экстракта сухого по сумме фенольных соединений в пересчете на гиперозид и по проантоцианидинам в пересчете на цианидин. Экспериментально обоснованы оптимальные условия экстрагирования, позволяющие получить БЛЭС, обогащенный целевыми биологически активными веществами – флавоноидами и проантоцианидинами.

Глава 5 посвящена разработке состава и технологии твердой лекарственной формы на основе березы листьев сухого экстракта производства ВИЛАР – твердых желатиновых капсул. Приведены технологическая схема и результаты определения показателей качества разработанного лекарственного препарата в процессе производства и хранения.

Основное содержание работы

Объекты и методы исследования.

Объектами исследования являлись измельченные листья березы и порошок листьев березы повислой (Betula pendula Rhoth), сем. Березовые (Betulaceae), собранные в июне-июле 2007, 2008, 2009 гг. и соответствующие требованиям проекта ФСП - 42-, разработанного ВИЛАР взамен ВФС – 42-2487-95, а также березы листьев экстракт сухой, полученный на производственно-экспериментальном заводе ЗАО ВИЛАР и отвечающий требованиям ФСП – 42-0171174801.

При проведении детального фитохимического анализа БЛЭС производства ЗАО ВИЛАР предварительно разделяли экстракт на полярные и липофильные метаболиты в смеси хлороформ-метанол-вода, которая при равном соотношении вода : хлороформ разделяется на две фазы.

Анализ фенольных соединений БЛЭС проводили с помощью системы ВЭЖХ La Chrom Merck-Hitachi с насосом L-7100, с диодным детектором для регистрации УФ-спектров в процессе хроматографии. Для разделения фенольных соединений использовали колонку «Chromolith Performance RP-18e» (100 x 4.6 мм; Merck KGaA, Darmstadt, Germany).

Для количественного определения индивидуальных фенольных соединений использовали калибровочные графики галловой кислоты, n-кумаровой кислоты, хлорогеновой кислоты, мирицетина, кверцетина и кемпферола, предоставленные Лабораторией органической химии и химической биологии Университета г. Турку (Финляндия).

Для идентификации фенольных соединений использовали ВЭЖХ-УФ-МС (система Agilent 1200 с BRUKER micrOTOF-Q-MS детектором) с колонкой «Superspher 100 RP-18» (LiChroCART 75 x 4 мм; Merck KGaA, Darmstadt, Germany).

Анализ соединений нефенольной природы осуществляли с помощью ГХ-МС (Perkin-Elmer GC AutoSystem XL с квадрупольным масс-спектрометром TurboMass Gold), используя капиллярную колонку (PE-5MS, 30 м, 0,25 мм, толщина слоя 0,25 мкм, Perkin-Elmer).

При разработке методик количественного определения суммы фенольных соединений в пересчете на гиперозид (после цветной реакции комплексообразования с алюминия хлоридом) и проантоцианидинов в пересчете на цианидин (после цветной реакции кислотного гидролиза в бутанольной среде) использовали двулучевые спектрофотометры UV-160 фирмы «Shimadzu» (Япония) и SPECORD® 250 (Германия) с программным обеспечением WinASPECT.

В ходе исследования влияния природы экстрагента на извлечения целевых биологически активных веществ экстракцию из листьев березы проводили трехкратно порциями чистого экстрагента (спирта этилового различной концентрации или воды очищенной) с интервалом в 1 час. Затем извлечения объединяли, выпаривали на лабораторном роторном вакуумном испарителе и высушивали в вакуумном сушильном шкафу при температуре 60°С и глубине вакуума -0,075 МПа.

Для оценки влияния измельченности сырья на выход целевых веществ листья березы дополнительно измельчали на микроизмельчителе тканей, имеющем лопасти в виде ножей. Размер частиц соответствовал требованиям проекта ФС “Березы листья” к порошку листьев березы (основная фракция – 0,25 – 2 мм).

При разработке лекарственного препарата, содержащего БЛЭС, технологические характеристики порошков и гранулятов, а также оценку качества полученных твердых желатиновых капсул определяли с помощью общепринятых в фармацевтической практике методик.

Определение срока годности разработанного лекарственного препарата проводили методом ускоренного старения при температуре 40°С и в естественных условиях, руководствуясь Временной инструкцией И-42-2-82 от 1983 г.

Детальное фитохимическое изучение состава БЛЭС.

Изучение состава фенольных соединений БЛЭС. Исследование состава БЛЭС производства ЗАО ВИЛАР методом ВЭЖХ показало, что основное количество фенольных соединений содержится во фракции полярных веществ, где были обнаружены флавоноиды (гликозиды мирицетина, кверцетина и кемпферола), галлоил-глюкоза, соединения n-кумароил-хинной кислоты. Идентифицирован также характерный для листьев B. рendula 3,4'-дигидроксипропиофенон-3--D-глюкопиранозид. Содержание основных фенольных соединений полярной фракции БЛЭС приведено в таблице 1.

Таблица 1.

Содержание основных фенольных соединений полярной фракции БЛЭС.

№ пика		Идентифицированное фенольное соединение	Содержание в мг/100 мг экстракта
4		1-Галлоилглюкоза	0,103
6		Неохлорогеновая кислота	0,168
8		транс-5-n-Кумароилхинная кислота	1,085
9		3,4'-Дигидроксипропиофенон-3--D-глюкопиранозид	2,947
12		Хлорогеновая кислота	0,356
13		Изохлорогеновая кислота	0,081
16		транс-3-n-Кумароилхинная кислота	0,908
17		цис-3-n-Кумароилхинная кислота	0,639
18		Изомер n-кумароилхинной кислоты	0,150
20		Мирицетин-3-глюкопиранозид	0,409
21		Мирицетин-3-глюкуронопиранозид	0,273
22		Мирицетин-3-галактопиранозид	0,307
23		Мирицетин-3-арабинофуранозид	0,063
	24	Кверцетин-3-глюкопиранозид	0,116
	25	Кверцетин-3-галактопиранозид	1,889
	26	Кверцетин-3-глюкуронопиранозид	1,073
	27	Кверцетин-3-арабинопиранозид	0,440
	28	Кверцетин-3- арабинофуранозид	0,186
	29	Кверцетин-3-рамнопиранозид	0,442
	30	Кемпферол-3-рамнопиранозид	0,146