Фармакогностическое исследование представителей родов origanum l. и rhododendron l. флоры восточной сибири

На правах рукописи

Мирович Вера Михайловна

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДОВ ORIGANUM L. И RHODODENDRON L. ФЛОРЫ ВОСТОЧНОЙ СИБИРИ

14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора фармацевтических наук

Улан-Удэ - 2010

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Иркутский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный консультант: доктор фармацевтических наук, профессор

Федосеева Галина Михайловна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Анцупова Татьяна Петровна

доктор фармацевтических наук

Боковикова Татьяна Николаевна

доктор фармацевтических наук, профессор

Федосеева Людмила Михайловна

Ведущая организация ГОУ ВПО «Башкирский государственный

медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному

развитию»

Защита состоится 03 июня 2010 г. в 10 часов на заседании Диссертационного совета ДМ 003.028.02 при Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН по адресу: 670047, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Бурятского научного центра СО РАН

Автореферат разослан __ _________ 2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

кандидат биологических наук Хобракова В.Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

В последние годы во всем мире остается высокий интерес к лекарственным препаратам, созданным на основе природного сырья.

В профилактике и комплексной терапии заболеваний органов дыхания широко используются растительные средства с антимикробным, противовоспалительным и иммуномодулирующим действием. Значительная часть таких средств создана на основе эфирных масел, природных полифенольных соединений, терпеноидов, полисахаридов (Машковский М.Д., 2008).

Распространенность патологии дыхательных путей носит глобальный характер и занимает одно из лидирующих мест в структуре заболеваемости по классам и группам болезней. Рост болезней органов дыхания обусловливается неблагоприятной экологической обстановкой, нерациональным питанием, стрессами, а также прогрессирующим ростом резистентности возбудителей патологии к широко применяемым и относительно новым антибиотикам, возрастающей этиологической ролью условно-патогенной микрофлоры (Чучалин А.Г., 2007; Стрельцова Е.Н., 2007).

В связи с этим была разработана Федеральная целевая программа «Концепция развития пульмонологической службы России на 2002-2007 годы». Одной из важных стратегий этой программы является разработка и внедрение для лечения и профилактики заболеваний органов дыхания отечественных препаратов.

Обоснованность применения растительных средств в профилактике и лечении заболеваний органов дыхания определяется тем, что к ним практически не наблюдается привыкания микроорганизмов, они сочетают в себе комплексы биологически активных веществ (БАВ), обусловливающих многопрофильное действие на основные стадии патологического процесса (Соколов С.Я., 2000).

Расширение ассортимента растительных средств, применяемых для лечения болезней органов дыхания, может осуществляться за счет углубленного изучения растений научной, а также народной медицины. Особого внимания заслуживают растения, имеющие в своем химическом составе несколько групп БАВ, сочетание которых расширяет и усиливает фармакотерапевтическое действие. Так представители родов Origanum L. и Rhododendron L. накапливают эфирные масла, тритерпеноиды, полифенольные соединения, для них свойственно разностороннее фармакологическое действие (Ткаченко К.Г. в соавт., 2002; Мурашкина И.А., 2003; Белоусов М.В., 2004; Рогачев А.Д., 2009).

Номенклатура растительных средств отхаркивающего и противовоспалительного действия, в частности на основе травы душицы ограничена. Душица обыкновенная – Origanum vulgare L. используется в виде настоя, в составе сбора грудного №1, а также многокомпонентного бальзама «Первопрестольный».

Растения рода Rhododendron L. в Восточной Сибири широко распространены, имеют достаточные сырьевые ресурсы, и, несмотря на проведенные ранее химико-фармакологические исследования, они не внедрены в медицинскую практику. Сравнительное фармакогностическое исследование восточносибирских рододендронов позволит решить вопрос о целесообразности использования отдельных видов в медицине в комплексном лечении заболеваний органов дыхания.

Таким образом, расширение ассортимента растительных средств, рекомендуемых в терапии заболеваний органов дыхания за счет растений родов Origanum L. и Rhododendron L., является актуальной задачей.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы является комплексное фармакогностическое исследование представителей родов Origanum L. и Rhododendron L. флоры Восточной Сибири для получения новых растительных средств антимикробного, противовоспалительного и иммуномодулирующего действия, предназначенных для лечения и профилактики заболеваний органов дыхания.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие основные задачи:

- изучить ассортимент растительных средств, применяемых для лечения заболеваний органов дыхания; дать анализ современного состояния изученности растений родов Origanum L. и Rhododendron L;

- разработать научно-методические подходы к поиску и исследованию растений Восточной Сибири как возможных источников средств для лечения и профилактики заболеваний органов дыхания;

- провести изучение химического состава душицы обыкновенной и видов рододендронов флоры Восточной Сибири; установить закономерности накопления и распределения БАВ по органам и фазам развития, обосновать рациональные сроки заготовки для указанных видов сырья;

- провести исследования по стандартизации перспективных видов сырья, разработать новую и усовершенствовать действующую нормативную документацию;

- разработать и экспериментально обосновать состав растительного сбора «Бронхофит», определить критерии подлинности, разработать методики количественного определения основных групп биологически активных веществ и нормы их содержания, составить проект Фармакопейной статьи предприятия;

- разработать технологии получения экстракционных средств из сбора «Бронхофит», травы душицы обыкновенной и побегов рододендрона Адамса, провести их стандартизацию.

Научная новизна работы

Сформулированы научно-методические подходы, в основе которых лежит проведение теоретических и экспериментальных исследований по поиску растений антимикробного, противовоспалительного и иммуномодулирующего действия, имеющих достаточный ресурсный потенциал, в дальнейшем осуществляется их комплексное фармакогностическое изучение и разработка одно- и многокомпонентных растительных средств.

В составе изучаемых растений выделено и идентифицировано 35 фенольных соединений: из них для рододендрона Адамса новых 5 фенольных соединений, для рододендрона мелколистного -10.

Впервые хромато-масс-спектрометрическим методом исследован состав эфирных масел. Идентифицировано 128 компонентов, из них для душицы обыкновенной впервые определено 22, для рододендрона Адамса -19, а рододендрона мелколистного - 34 компонента эфирного масла.

Выявлены закономерности накопления отдельных групп БАВ в душице обыкновенной, обусловленных климато-географическими факторами. Установлено, что душица обыкновенная, произрастающая в сибирском регионе, относится к хеморасе, характеризующейся низким содержанием фенольной фракции (соединений тимола и карвакрола) в составе эфирного масла, а накопление флавонов (производных лютеолина и апигенина) зависит от географической широты и климатических условий. Впервые изучена динамика накопления БАВ у восточносибирских видов рододендронов по органам и фазам развития, установлено, что их максимальное количество накапливают листья и побеги текущего года в период плодоношения.

Разработана рецептура грудного сбора «Бронхофит», содержащего БАВ антимикробного, противовоспалительного, иммуномодулирующего и антиаллергического действия. Изучен его химический состав: идентифицировано 55 компонентов эфирного масла и 16 фенольных соединений, обнаружены незаменимые аминокислоты и эссенциальные для иммунной системы микроэлементы.

Определены оптимальные условия получения экстрактов из сбора «Бронхофит», душицы обыкновенной и рододендрона Адамса. Для них установлены показатели подлинности и предложены методики количественного определения основных групп БАВ.

Эффективность и безопасность разработанных средств подтверждена биолого-фармакологическими испытаниями.

Новизна полученных результатов подтверждена 6 патентами РФ и авторским свидетельством.

Практическая значимость

Результаты фармакогностических, химических и фармакологических экспериментов свидетельствуют о перспективности разработки новых эффективных растительных средств для лечения и профилактики заболеваний органов дыхания с использованием душицы обыкновенной дикорастущей и культивируемой, а также видов рододендронов флоры Восточной Сибири.

Разработан проект изменения № 2 к ФС 55 «Трава душицы». Проект изменения, пояснительная записка, таблицы аналитических данных, материалы сравнительного изучения с аналогами находятся на рассмотрении в Фармакопейном комитете (письмо № 773/07 от 25.09.2008 г). Методика количественного определения суммы флавоноидов в траве душицы включена в межгосударственный стандарт «Трава душицы» (ГОСТ 2103-93), являющийся действующим по настоящее время.

Предложены способы получения экстрактов, которые могут быть реализованы в условиях фармацевтического производства: «Бронхофит» экстракт сухой, душицы экстракт жидкий (1:1), рододендрона Адамса экстракты жидкий (1:2) и сухой.

Разработаны проекты: ФСП 42-0048-55564631-08 на сбор «Бронхофит», ФСП 42-0049-55564631-08 «Рододендрона Адамса побеги», ФСП 42-0050-55564631-08 «Бронхофит» экстракт сухой», которые приняты в ООО «Русский лес» к рассмотрению и включены в план перспективного развития предприятия.

Материалы исследований включены в методические пособия, два из которых изданы с грифом УМО: «Охрана лекарственных и редких исчезающих растений» (Иркутск, 2002, 99 с.); «Морфологический анализ растений и лекарственного растительного сырья. Характеристика и представители основных растительных семейств» (Иркутск, 2003, 96 с.); «Микроскопические диагностические признаки лекарственных растений народной медицины Восточной Сибири» (Иркутск, 2007, 114 с); «Фитохимический анализ растений и сырья, содержащих простые фенольные соединения и кумарины» (Иркутск, 2009, 47 с). Материалы диссертации используются в учебном процессе при изучении фармакогнозии, основ экологии и охраны природы, а также на факультете повышения квалификации провизоров.

По результатам исследований в соавторстве опубликована монография «Дикорастущие и культивируемые лекарственные растения Восточной Сибири» (Иркутск, 2010, 192 с).

Положения, выдвигаемые на защиту:

- обоснование перспективности растений родов Origanum L. и Rhododendron L. флоры Восточной Сибири для разработки на их основе новых эффективных растительных средств, предназначенных для лечения заболеваний органов дыхания;

- результаты фитохимического изучения душицы обыкновенной и видов рододендронов восточносибирского региона, исследования закономерностей накопления БАВ в зависимости от некоторых экологических факторов;

- результаты исследований по стандартизации сырья душицы обыкновенной и рододендрона Адамса, материалы по разработке и совершенствованию нормативной документации на указанные виды сырья;

- результаты теоретических и экспериментальных исследований по разработке состава и стандартизации сбора «Бронхофит»;

- результаты по разработке технологии и показателей качества экстракционных средств.

Конкретное участие автора в получении научных результатов

Основная часть исследований (85% общего объема) выполнена лично автором. Отдельные фрагменты работы по стандартизации сырья душицы обыкновенной и побегов рододендрона Адамса проведены совместно с доцентом каф. фармакогнозии СПХФА Р.К. Шатохиной и ассистентом каф. фармакологии ИГМУ А.И. Левентой. Фармакологические исследования проведены на кафедре фармакологии и Центре лабораторной диагностики ИГМУ под руководством д-ра мед. наук, профессора Л.А Усова.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы были представлены на конференциях: - первом международном научном конгрессе «Традиционная медицина и питание: теоретические и практические аспекты» (Москва, 1994); - «Состояние и перспективы научных исследований в области фармации» (Самара, 1996); - «Сохранение разнообразия в Байкальском регионе» (Улан-Удэ, 1996, 1997); - международном симпозиуме «Россия - Германия: история, культура, наука» (Иркутск, 1999); - международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2003); - «Лекарственные растения в фармакологии и фармации» (Барнаул, 2004); - «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2004, 2006-2009); - «Traditional medicine: a current situation and perspectives development: materials of the III international scientific conference» (Ulan-Ude, 2008); - «Фармация Казахстана: интеграция науки, образования и производства» (Шымкент, 2009).

Связь задач исследований с проблемным планом

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом основных научных исследований ГОУ ВПО «Иркутский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по комплексной теме: «Изучение перспективных лекарственных растений Восточной Сибири» (номер государственной регистрации 01.2.00304320).

Публикации

Содержание работы отражено в 54 научных работах, из которых 16 статей в периодических изданиях, рекомендованных ВАК МО и науки РФ, 1 монография, 6 патентов РФ на изобретение и 1 авторское свидетельство.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 308 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований (4 главы), выводов, списка использованной литературы, включающего 334 источников, из которых 81 – на иностранных языках и приложений. Работа иллюстрирована 79 таблицами и 71 рисунком.

В первой главе дан анализ ассортимента растительных средств, применяемых при заболеваниях органов дыхания, и обоснована необходимость его расширения, а также проанализированы результаты современного состояния изученности растений родов Origanum L. и Rhododendron L.

Вторая глава содержит характеристику объектов, описание методов исследований и способы статистической обработки результатов.

Последующие 4 главы посвящены комплексному фармакогностическому исследованию душицы обыкновенной и видов рододендронов. В разделе «Заключение» обсуждены полученные результаты и перспективы их практического применения, а также изложены научно-методические подходы к поиску и изучению лекарственных растений Восточной Сибири перспективных для разработки новых эффективных растительных средств, предназначенных для лечения заболеваний органов дыхания.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования

Образцы сырья представителей рода Rhododendron (рододендрон Адамса – Rh. adamsii Rehder, р. мелколистный - Rh. parvifolium Adams, р. даурский – Rh. dahuricum L. и р. золотистый – Rh. aureum Georgi) заготавливали на территории Иркутской области и Бурятии. Сырье душицы обыкновенной - Origanum vulgare L. было собрано в Иркутской области, Ставропольском крае, Новосибирской области, а также использовались коммерческие образцы. Образцы сырья душицы обыкновенной культивируемой собирали в питомнике лекарственных растений Иркутского государственного медицинского университета.

Растительное сырье для разработки и исследования сбора «Бронхофит» было приобретено через аптечную сеть и соответствовало требованиям нормативной документации.

Анатомическое исследование растительного сырья проводили по методике, описанной в ГФ XI, вып. 1. Микропрепараты изучали и фотографировали на световом инвестированном микроскопе «Zeiss Axiovert 200» с обработкой фотографий в программе Windows Adobe Photoshop 7,0.

Спектральные исследования проводили на приборах СФ-46; СФ-26; Unicam SP-800; Specord UV-Vis, FTLR Perkin Elmer Spectr One; ЯМР-спектры снимали на приборе VXR-500S фирмы «Varian».

Состав эфирного масла исследовали на газовом хроматографе Agilent Technologies (6890N), с квадрупольным масс-спектрометром (MSD 5973) в качестве детектора, на кварцевой колонке HP- 5MS. Идентификацию соединений проводили путем сравнения полных масс-спектров и времен удерживания с соответствующими данными чистых соединений и по данным масс-спектральной библиотеки NIST.

Исследования методом ВЭЖХ проводили на приборах «GILSTON» и «Shimadzu>

Качественный и количественный состав аминокислот исследовали с помощью аминокислотного анализатора KLA-3B (Hitachi, Япония).

Изучение элементного состава образцов проводили на квадрупольном масс-спектрометре Agilent 7500 ce c использованием инертной системы ввода образца.

Золу общую и золу, нерастворимую в 10% растворе кислоты хлористоводородной определяли на приборе ММ «Мелистон».

При разработке методик количественного определения использовали государственные стандартные образцы (ГСО): лютеолин – ФС 42-0174-06; кверцетин – ТУ 9369-139-04868244-07, гиперозид – ФС 42-0106-03 и лютеолин-7-глюкозид – ФС 42-0175-06.

Использованы статистические методы обработки результатов химического эксперимента и биологических испытаний (ГФ XI).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Фитохимическое изучение душицы обыкновенной и видов рододендронов, произрастающих в Восточной Сибири

Выделение суммы фенольных соединений проводили по схеме (рис. 1). Для изучения состава агликонов флавоноидов в очищенных водных экстрактах изучаемых растений проводили ферментативный (душица обыкновенная) и кислотный (рододендроны) гидролиз. При разделении агликонов флавоноидов колоночной и препаративной бумажной хроматографией было выделено 8 агликонов (1-8). Исследования УФ-, ИК-спектров показали, что флавоноиды душицы обыкновенной являются производными лютеолина, апигенина, хризина и 5-оксифлавона; рододендрона Адамса - производными кверцетина, мирицетина и азалеатина; рододендрона мелколистного – кверцетина, мирицетина и дигидрокверцетина; даурского - кверцетина, мирицетина; золотистого – кверцетина (табл. 1).

Далее проводили изучение состава нативных флавоноидов душицы обыкновенной, рододендронов Адамса и мелколистного. Извлечения из сырья получали по схеме (рис. 1), разделение флавоноидов проводили на колонках, заполненных полиамидом.