Определение индикаторных фенольных соединений нефлавоноидной природы в лекарственном и пищевом растительном сырье методом вэжх

На правах рукописи

РЫЛИНА ЕЛЕНА ВАЛЕРЬЕВНА

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНДИКАТОРНЫХ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ НЕФЛАВОНОИДНОЙ ПРИРОДЫ В ЛЕКАРСТВЕННОМ И ПИЩЕВОМ РАСТИТЕЛЬНОМ СЫРЬЕ МЕТОДОМ ВЭЖХ

14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

МОСКВА – 2010

Работа выполнена в ГОУ ВПО Первый Московский Государственный Медицинский Университет имени И.М. Сеченова

Научные руководители:

Академик РАМН, доктор фармацевти-

ческих наук, профессор Арзамасцев Александр Павлович

Доктор химических наук, профессор Эллер Константин Исаакович

Доктор фармацевтических наук,

профессор Прокофьева Вера Ивановна

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук Гравель Ирина Валерьевна

Доктор фармацевтических наук Боковикова Татьяна Николаевна

Ведущая организация:

Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН

Защита состоится « 20 » _декабря_ 2010 г. в 14 часов на заседании Диссертационного Совета Д.208.040.09 при Первом Московском Государственном Медицинском Университете имени И.М. Сеченова по адресу: 119019, г. Москва, Никитский бульвар, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинской библиотеке Первого Московского Государственного Медицинского Университета имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, 49.

Автореферат разослан «___» _______________ 2010 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д.208.040.09,

доктор фармацевтических наук,

профессор Наталья Петровна Садчикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Использование лекарственных препаратов на растительной основе становится в последнее время все более актуальным. Такие лекарственные препараты обладают многочисленными положительными эффектами при минимальном количестве побочных действий. Одними из важнейших компонентов растительных экстрактов являются полифенольные антиоксиданты. Наряду с более изученными флавоноидами и производными гидроксикоричных кислот эта группа включает фенольные соединения нефлавоноидной природы (ФСНП), среди которых высокой биологической активностью обладают производные дигидроксистильбена (ресвератрол и пицеид), п-гидроксифенилэтанола (тирозол, гидрокситирозол и салидрозид), 1,4-дигидроксибензола (гидрохинон и арбутин) и 1,3,5-тригидроксибензола (флороглюцина) (флоретин и флоридзин), обладающие антиоксидантными, противовоспалительными, антивирусными, антибактериальными и антиаллергенными свойствами и другими типами биологической активности.

Описание некоторых лекарственных растений, содержащих ФСНП, легли в основу статей ряда зарубежных фармакопей (Европейской (Ph. Eur. VI), Британской (BP 2009), Французской (Ph. Fr. X), Немецкой (DAB 2008), Американской травяной (AHP 2008), Японской (JP 15), Китайской) на корневища и корни горца гребенчатого, лист винограда культурного и вино из него, листья толокнянки обыкновенной, лист и масло оливы европейской, плоды яблони домашней. В отечественной нормативной документации качественный и количественный анализ ФСНП встречается только в трех статьях ГФ XI: определение салидрозида в корневищах и корнях родиолы розовой, определение арбутина в листьях брусники обыкновенной и толокнянки обыкновенной. Статья ГФ XI на корневища бадана, несмотря на высокое содержание в нем арбутина и гидрохинона, нормирует содержание только малоспецифичных дубильных веществ, не являющихся индикаторными компонентами сырья.

Идентификация и количественное содержание ФСНП в этих растениях и продуктах на их основе может позволить рассматривать их в качестве источника соответствующих ФСНП и при разработке и производстве лекарственных препаратов на их основе. Необходимость определения незначительных концентраций ФСНП на фоне сложного матрикса предъявляет высокие требования к селективности и чувствительности методов анализа, поэтому для проведения работ нами был выбран метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Цель и задачи исследования

Цель: исследовать различные лекарственные и пищевые растительные источники на наличие фенольных соединений нефлавоноидной природы, установить их количественное содержание. Для достижения этой цели поставлены следующие задачи.

• Изучить физико-химические свойства ФСНП (растворимость, УФ- и видимые спектры, хроматографическая подвижность).
• Подобрать оптимальные хроматографические условия анализа ФСНП на фоне сложного матрикса растительных объектов и продуктов на их основе.
• Разработать методики пробоподготовки для сырья и продуктов на его основе, обеспечивающие наибольшую эффективность экстракции ФСНП из объектов при невысокой трудоемкости.
• Оценить хроматографические параметры, метрологические характеристики, провести валидацию методик количественного определения.
• Апробировать разработанные методики на лекарственном и пищевом растительном сырье, продуктах их переработки и лекарственных препаратах на их основе.
• Подготовить проекты нормативной документации для лекарственного и пищевого растительного сырья, продуктов их переработки и лекарственных препаратов на их основе, содержащих ФСНП.

Научная новизна результатов исследования

Разработаны оригинальные методики идентификации и количественного определения индикаторных фенольных соединений нефлавоноидной природы: ресвератрола и пицеида в горце гребенчатом и винограде культурном; тирозола, гидрокситирозола и (или) салидрозида в родиоле розовой, красной щетке и оливе европейской; гидрохинона и арбутина в бруснике обыкновенной, толокнянке обыкновенной, бадане толстолистном и груше обыкновенной; флоретина и флоридзина в яблоне домашней.

Практическое значение результатов исследования

Результаты работы переданы для использования в соответствующих статьях 4 части ГФ XII и включены в сборник «Методы анализа минорных биологически активных веществ пищи». Разработанные методики применялись при экспертизе более 100 образцов лекарственного и пищевого растительного сырья и продуктов на их основе для целей государственной регистрации БАД к пище растительного происхождения.

Апробация работы

Результаты исследований доложены на Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (май 2007, Рязань); Всероссийском симпозиуме «Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях» (к юбилею профессора О. Г. Ларионова) (июль 2007, Москва), Х Всероссийском съезде гигиенистов и санитарных врачей «Итоги и перспективы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации» (ноябрь 2007, Москва), Конгрессе «Фитофарм 2008» (июнь 2008, Санкт-Петербург), XI Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье» (ноябрь 2008, Москва), на научных конференциях кафедры фармацевтической и токсикологической химии ММА им. И.М.Сеченова (с августа 2010 г Первый МГМУ им. И.М. Сеченова) (2006 – 2010 гг.); Конгрессе «Фитофарм 2010» (июнь 2010, Санкт-Петербург).

Апробация работы проведена на межлабораторной конференции кафедры фармацевтической и токсикологической химии фармацевтического факультета Первого МГМУ им И.М. Сеченова 4 октября 2010 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендуемых ВАК России.

Связь исследования с проблемным планом фармацевтических наук

Диссертационная работа выполнена в рамках НИР кафедры фармацевтической и токсикологической химии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова «Совершенствование контроля качества лекарственных средств», № госрегистрации 01.200.110545, «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований. Рег. № 01.2.006.06352».

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 112 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов исследования и их обсуждения, выводов и библиографического указателя, включающего 95 источников. Работа проиллюстрирована 42 рисунками и 32 таблицами.

Положения, выносимые на защиту:

Разработка методик определения индикаторных ФСНП методом ВЭЖХ:

• ресвератрола и пицеида в горце гребенчатом и винограде культурном;
• тирозола, гидрокситирозола и (или) салидрозида в родиоле розовой, красной щетке и оливе европейской;
• гидрохинона и арбутина в бруснике обыкновенной, толокнянке обыкновенной, бадане толстолистном и груше обыкновенной;
• флоретина и флоридзина в яблоне домашней;

Сравнительные данные по идентификации и количественному содержанию ФСНП в лекарственном и пищевом растительном сырье, продуктах их переработки и лекарственных препаратах на их основе.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты исследования

Лекарственное и пищевое растительное сырье, продукты их переработки и лекарственные препараты на их основе.

Стандартные образцы

При разработке методик и проведении аналитических исследований по содержанию индикаторных фенольных соединений в качестве стандартных образцов использовались коммерчески доступные индивидуальные вещества (производства «Sigma-Aldrich Co» и «ChromaDex»).

Оборудование

Жидкостной хроматограф «Agilent 1100 series» (США) с УФ-спектрофотометрическим детектором на диодной матрице (ДМД), флуориметрическим детектором (ФЛД), в качестве неподвижной фазы использовалась хроматографическая колонка Waters Symmetry C18, 5 мкм, 250х4,6 мм (Ирландия). Управление системой и обработка хроматограмм осуществлялась при помощи программы «ChemStation A.09.03».

Разработка методики ВЭЖХ-определения ресвератрола и пицеида в лекарственном и пищевом растительном сырье, а также продуктах их переработки на основе горца гребенчатого и винограда культурного.

Для выбора оптимальной аналитической длины волны детектирования были изучены УФ-спектры имеющихся стандартных образцов производных дигидроксистильбена: транс-ресвератрола (в дальнейшем ресвератрол) и транс-пицеида (в дальнейшем пицеид). Было показано, что они имеют максимумы поглощения при длинах волн 215-220 и 307-318 нм (см. рис. 1). В качестве аналитической длины волны детектирования предпочтительно использование полос поглощения с большей длиной, как более специфичной. Кроме этого коэффициент молярной экстинкции при 307 нм имеет большую величину по сравнению с диапазоном 215-220 нм. На основании этого детектирование ресвератрола и пицеида при ВЭЖХ исследовании проводили при длине волны 307 нм.

Рис.1. УФ-спектр раствора стандартного образца ресвератрола.

При подборе оптимальных условий хроматографического разделения использовались следующие подвижные фазы: изократическое элюирование смесями: 1) метанол : водный раствор фосфорной кислоты (ФК) (рН 2.5, в соотношениях 45:55 и 40:60), 2) ацетонитрил : водный раствор ФК (рН 2.5, в соотношениях 25:75 и 30:70), 3) ацетонитрил : водный раствор трифторуксусной кислоты (ТФУ) (рН 2.5, в соотношении 30:70); 4) градиентное элюирование смесью ацетонитрил : водный раствор ТФУ (рН 2.5, от 15:85 до 35:65 за 30 минут). Оптимальное разделение, давление в колонке и время удерживания соединений было достигнуто в третьем случае. Примеры хроматограмм представлены на рис. 2 и 3. В процессе работы был проведен подбор условий экстракции ресвератрола и пицеида из растительного сырья (состав экстрагента, время). Были исследованы водные растворы этанола с концентрациями 5%, 20%, 35%, 50%, 65%, 80% и 96%; водные растворы метанола с концентрациями 5%, 20%, 35%, 50%, 65%, 80%, 90% и 100%, а также водный экстракт. Проводилось исследование влияния длительности экстракции на ее полноту (15, 30, 45 и 60 минут). Водный экстракт показал наименьший результат в сравнении с водно-спиртовыми смесями, где содержание возрастало вместе с концентрацией спирта до значения концентрации 80%, при использовании метанола значения также были выше. В экстрактах с более высоким содержанием спирта наблюдалось уменьшение абсорбции при длине волны 307 нм. Оптимальными условиями для экстракции является использование 80% метанола при нагревании на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 30 минут.

		Рис. 2. Хроматограмма смеси растворов стандартных образцов при 307 нм. Времена удерживания пицеид – 5,1 мин, ресвератрол – 8,3 мин.
А		Рис. 3. А. Хроматограмма экстракта горца гребенчатого. Б. Хроматограмма виноградного сока.
Б

Подготовка проб для анализа растительного сырья: образец сырья тщательно измельчают, отбирают около 1,00 г (точная навеска), помещают в круглодонную колбу объемом 100 мл, экстрагируют 50 мл 80% раствора метанола в течение 30 минут на водяной бане с обратным холодильником при перемешивании. После этого пробу обрабатывают ультразвуком в течение 10 минут, фильтруют, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, и доводят объем раствора до метки 80% метанолом.

Подготовка проб для анализа растительных экстрактов: около 100 мг экстракта (точная навеска) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляют около 50 мл 80% раствора метанола, растворяют и доводят объем раствора до метки 80 % раствором метанола.

Подготовка проб для анализа соков, нектаров и вин: около 10,00 г (точная навеска) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора водой до метки. Все полученные растворы перемешивают и фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм или центрифугируют при 14000-15000 об/мин.

Были рассчитаны параметры пригодности хроматографической системы (таблица 1), валидационные характеристики (таблица 2), произведена метрологическая оценка (таблица 3) разработанной методики, построен калибровочный график (рис. 4).

Таблица 1

Параметры пригодности хроматографической системы для определения ресвератрола и пицеида в условиях изократического элюирования, t0=2,2.

Соединение	tR, мин.	k’	N	0,5		R
Пицеид	5,1	1,32	14079	0,1012	2,1	15,03
Ресвератрол	8,3	2,77	17107	0,1493

Таблица 2

Параметры валидации методики ВЭЖХ для количественного определения ресвератрола и пицеида в образцах при введении пробы объемом 10 мкл.

Соединение	Предел обнаружения сигнал-шум 3:1,мг/кг	Предел кол. определения сигнал-шум 10:1, мг/кг		Диап лин. концен траций, мг/кг	Коэфф. ко рреляции
Пицеид	0,88	4,2		4,2-50000	0,9983
Ресвератрол	0,73	3,6		3,6-500000	0,9967
			Рис. 4. Калибровочный график для количественного определения пицеида (уравнение 70,27х+60,26) и ресвератрола (уравнение 64,837х-132,24).

Таблица 3

Метрологические характеристики методики анализа.

Соединение	Х ср	S2	S		t (,f)	х	%
Пицеид	40	2,003	1,415	0,05	2,78	1,764	4,37
	35000	51595,76	227,15	0,05	2,78	283,173	0,81
Ресвератрол	60	3,942	1,985	0,05	2,78	2,475	4,14
	110000	1540261	1241,1	0,05	2,78	1547,16	1,40

Было изучено содержание ресвератрола и пицеида в образцах сырья, а также продуктах на основе горца гребенчатого и винограда (см. табл. 4 и 5).

Таблица 4

Содержание ресвератрола и пицеида в образцах.

Образец	Содержание, мг/г
	реcвератрол	пицеид
Корневища горца гребенчатого	170,62	1,07
Экстракт корневищ горца гребенчатого	209,11 – 899,21	1,23 – 2,14
Экстракт косточек (семян) красного винограда	0,06 – 0,13	0,01
Экстракт листьев красного винограда	0,07	0,01
Экстракт кожицы красного винограда	0,08 – 0,14	0,02 – 0,13
Содержание в напитках, мг/л
Соки и вина на основе красного винограда	0,07 – 1,67	0,21 – 13,97
Соки и вина на основе белого винограда	0,02 – 0,68	0 – 4,86