Исследование содержания фенолокислот в лекарственном и пищевом растительном сырье методом вэжх

На правах рукописи

МЕДВЕДЕВ ЮРИЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ФЕНОЛОКИСЛОТ В ЛЕКАРСТВЕННОМ И ПИЩЕВОМ РАСТИТЕЛЬНОМ СЫРЬЕ МЕТОДОМ ВЭЖХ

14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

МОСКВА – 2010

Работа выполнена в ГОУ ВПО Московская Медицинская Академия

имени И.М. Сеченова

Научные руководители:

Академик РАМН, доктор фармацевтических наук,

профессор Арзамасцев Александр Павлович

Доктор химических наук, профессор Эллер Константин Исаакович

Доктор фармацевтических наук,

профессор Прокофьева Вера Ивановна

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук,

профессор Киселева Татьяна Леонидовна

доктор фармацевтических наук Боковикова Татьяна Николаевна

Ведущая организация:

Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН

Защита состоится «_____» __________________2010 г. в ____ часов на заседании Диссертационного совета Д.208.040.09 при Московской Медицинской Академии им. И. М. Сеченова по адресу: 119019, г. Москва, Никитский бульвар, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской Медицинской Академии им. И. М. Сеченова, по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, д.49

Автореферат разослан «_____»_________________2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета Д.208.040.09,
доктор фармацевтических наук, профессор		Наталья Петровна Садчикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Гидроксикоричные кислоты (ГКК) являются наиболее распространенными полифенольными кислотами в высших растениях. Основными ГКК являются: кафтаровая, хлорогеновая и её изомеры, цикориевая, изомеры дикофеоилхинной (цинарина), феруловая, ферулоилхинная и её изомеры.

ГКК проявляют выраженные антиоксидантные и антирадикальные свойства в тестах in vitro, описаны иммуностимулирующая, противовирусная и противовоспалительная активность.

В настоящее время в отечественной нормативной документации на лекарственные растения и продукты на их основе ГКК упоминается редко (для эхинацеи и артишока). Для BP 2009, USP 30, JP 15 характерно большее количество лекарственных растений, в которых нормируется содержание ГКК (трава и корни эхинацеи, листья артишока, листья ясеня обыкновенного, цветки белокудренника черного, листья крапивы двудомной, листья розмарина лекарственного, листья мелисы лекарственной, корневища и корни шалфея лекарственного). Однако, учитывая важную физиологическую роль для растений можно предположить гораздо большее распространение ГКК.

Другой актуальной проблемой является разработка и внедрение унифицированного метода анализа ГКК, позволяющего определять больший спектр кислот, чем в действующей нормативной документации.

Учитывая вышесказанное, актуальной является разработка унифицированного метода анализа ГКК и исследование с его помощью различного лекарственного растительного сырья, растительных экстрактов, БАД к пище и пищевых продуктов.

Цель и задачи исследования: Цель настоящей работы заключалась в исследовании различных лекарственных и пищевых растительных источников на содержание гидроксикоричных кислот.

Задачи исследования:

Научная новизна. Разработаны оригинальные методики идентификации и количественного определения гидроксикоричных кислот в лекарственном и пищевом растительном сырье, БАД к пище и пищевых продуктах.

Практическая значимость. Разработанная методика использована для исследования ГКК в 115 наименованиях лекарственного и пищевого растительного сырья. Методика определения гидроксикоричных кислот включена в «Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище» (дополнение к Р4.1.1672-03, Минздрав РФ).

Методика была успешно применена в НИИ питания РАМН при гигиенической экспертизе более 90 образцов сырья для БАД к пище и БАД к пище в НИИ питания РАМН.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на XI Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье», (ноябрь 2008 г., г. Москва), на научных конференциях кафедры фармацевтической химии с курсом токсикологической химии ММА им. И.М.Сеченова (2006 – 2009 гг.); конгрессе «Фитофарм 2008» (июнь 2008 г., Санкт-Петербург), XII Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье», (декабрь 2009 г., г. Москва), XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», (2010 г., г. Москва).

Апробация работы проведена на межлабораторной конференции кафедры фармацевтической химии с курсом токсикологической химии фармацевтического факультета ММА им. И. М. Сеченова (19 января 2010 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе одна статья в издании, рекомендуемом ВАК России.

Связь исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в рамках НИР кафедры фармацевтической химии ГОУ ММА им. И.М. Сеченова «Совершенствование контроля качества лекарственных средств», № госрегистрации 01.200.110545. «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований. Рег. № 01.2.006.06352».

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения полученных результатов, выводов, списка литературы.

Диссертация изложена на 144 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов исследования и их обсуждения, выводов и библиографического указателя, включающего 102 источника, 72 из которых зарубежные. Работа иллюстрирована 21 рисунком и 31 таблицей.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработка методики ВЭЖХ количественного определения ГКК: ­ хлорогеновой, неохлорогеновой, криптохлорогеновой, кафтаровой, кофейной, р-кумаровой, феруловой, цикориевой, дикофеоилхинных, дикофейной, ферулоилхинных кислот в лекарственном и пищевом растительном сырье.
2. Результаты изучения содержания и состава гидроксикоричных кислот в лекарственном и пищевом растительном сырье.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты исследования

Лекарственное и пищевое растительное сырье, продукты их переработки, БАД к пище, сертифицируемые в НИИ питания РАМН.

Стандартные образцы

При разработке методик и проведении аналитических исследований по содержанию ГКК в качестве стандартных образцов использовались коммерчески доступные индивидуальные вещества (производства «Sigma-Aldrich Co», «Fluka», «ChromaDex»).

Хроматографическая система

Жидкостной хроматограф «Agilent 1100 Series» (США) с дегазатором, насосом, обеспечивающим одновременную подачу 2-х растворителей, устройством для автоматического ввода проб, термостатом, фотодиодноматричным детектором и масс-детектором «Agilent LC/MSD Trap SL family» (США). Управление системой и обработку полученных хроматограмм осуществляли при помощи программы «Chemstation А.09.03».

Условия хроматографирования и детектирования

Для выбора оптимальной аналитической волны детектирования были изучены УФ-спектры имеющихся стандартов ГКК. Было показано, что ГКК имеют несколько максимумов поглощения: при 220-230 нм и 320-330 нм. Для р-кумаровой кислоты также характерно наличие двух максимумов поглощения в УФ-спектре - при 225-230 нм и 308-313 нм (см. рис. 1 и 2).

В качестве аналитической волны детектирования предпочтительно использование полос поглощения с большей длиной, как более специфичной. Кроме этого коэффициент молярной экстинкции ГКК в диапазоне 320-330 нм (для производных р-кумаровой к-ты 308-313 нм) имеет большую величину по сравнению с диапазоном 220-230 нм.

На основании полученных данных детектирование ГКК при ВЭЖХ исследовании проводили при длине волны 330 нм, детектирование производных р-кумаровой кислоты – при длине волны 310 нм.

Рис. 1. УФ - спектр стандарта хлорогеновой (5-КХК) кислоты.

Рис. 2. УФ - спектр стандарта р-кумаровой кислоты.

Для выбора оптимальных условий (наибольшая чувствительность и специфичность) масс-детектирования и фрагментации ГКК при ВЭЖХ - исследовании были изучены масс-спектры имеющихся стандартов и проведена их фрагментация. Для этого имеющиеся рабочие стандартные растворы вводились непосредственно в масс-детектор.

В дальнейшем масс – детектирование проводили в следующих условиях: ионизация электроспреем с распылением азотом; небулайзер 70 psi; температура осушающего газа 350°С, скорость 12 л/минуту; полярность отрицательная; сканирование в диапазоне 100-800 m/z с разрушением ионов, соответствующим молекулярным массам исследуемых кислот.

В рамках подбора оптимальных условий хроматографического разделения использовались следующие варианты подвижной фазы: изократическое элюирование смесью ацетонитрил – фосфатный буферный раствор 0,025 мМоль с рН=2,5 (в различных соотношениях, от 10 % до 25 % ацетонитрила); градиентное элюирование смесью ацетонитрил – фосфатный буферный раствор 0,025 мМоль с рН=2,5; градиентное элюирование смесью ацетонитрил – водный раствор трифторуксусной кислоты (ТФУ) с рН=2,5; градиентное элюирование смесью ацетонитрил – водный раствор муравьиной кислоты с рН=2,5. Разделение проводили на колонках Thermo Hypersil ODS (2) column 250x4,6мм 5мкм; Phenomenex Luna C18 (2) 250х4,6мм 5мкм; Supelco Discovery C18 250х4,6мм 5мкм.

В дальнейшем, как наиболее оптимальный, использовался следующий вариант хроматографического разделения:

Подвижная фаза. Компонент A: ацетонитрил; компонент B: к 1 л дистиллированной деионизированной воды добавляли концентрированную муравьиную кислоту до рН 2,5. Форма градиента – линейная: 0 мин 12% «А», 30 мин 25% «А», 40 мин 40% «А», 41 мин 80% «А», 42 мин 80% «А», 43 мин 12% «А», 45 мин 12% «А». Общее время анализа - 45 минут. Скорость потока: 0,9 мл/мин. Объем вводимой пробы: 5-100 мкл. Колонка Supelco Discovery C18 HPLC 250x4,6мм 5мкм; температура термостата 25°С. Примеры хроматограмм представлены на рис. 3 и 4.

Рис. 3. Типичная ВЭЖХ - хроматограмма ГКК (УФ-детектор при длине волны 330 нм) на примере экстракта артишока.

В процессе работы был проведен подбор условий проведения экстракции ГКК из растительного сырья и пищевых продуктов (состав экстрагента, время).

Рис. 4. Типичная ВЭЖХ - хроматограмма ГКК (масс-детектор, общий ионный ток) на примере экстракта артишока.

Были исследованы следующие варианты: водные растворы этанола с концентрацией 15%, 30%, 45%, 60%, 75%, 90%, 100%; водные растворы метанола с концентрацией 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%; смесь метанол-этанол-вода (25:25:50); водное извлечение (настой или отвар в зависимости от вида сырья). Проводилось исследование влияния времени на полноту экстракции (15, 30, 45 и 60 минут).

Было показано, что оптимальными условиями экстракции являются использование смеси метанол : вода (6:4) при нагревании на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 15 минут.

Пробоподготовка

Подготовка проб для анализа растительного сырья: образец сырья тщательно измельчают, отбирают около 1,00 г (точная навеска), помещают в круглодонную колбу объемом 100 мл, экстрагируют 50 мл 60 % раствора метанола в течение 15 минут на кипящей водяной бане с обратным холодильником при перемешивании. После этого пробу обрабатывают ультразвуком в течение 10 мин, фильтруют, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора до метки 60% метанолом.

Подготовка проб для анализа растительных экстрактов: около 0,5 г (точная навеска) экстракта помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляют около 50 мл 60% раствора метанола, растворяют, доводят объем раствора до метки 60 % метанолом.

Подготовка проб для анализа соков: около 10 г (точная навеска) фруктового сока помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем до метки водой.

Полученные растворы тщательно перемешивают и фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм, при необходимости центрифугируют на центрифуге при 14000-15000 об/мин.

Хроматографические характеристики и параметры пригодности хроматографической системы

Были рассчитаны хроматографические характеристики и параметры пригодности хроматографической системы разработанной методики (таблица 1), валидационные характеристики (таблица 2), произведена метрологическая оценка методики (таблица 3).

Таблица 1

Параметры разделения гидроксикоричных кислот в условиях градиентного режима, скорость фазы 0,9 мл/мин, мертвый объем t0=3,1