Разработка способа получения и стандартизация экстракта жидкого противодиабетического

На правах рукописи

СМОЛЬНИКОВА ВАЛЕНТИНА ПЕТРОВНА

РАЗРАБОТКА СПОСОБА ПОЛУЧЕНИЯ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ЭКСТРАКТА ЖИДКОГО ПРОТИВОДИАБЕТИЧЕСКОГО

14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

Пермь, 2012

Диссертационная работа выполнена в ГБОУ ВПО «Дальневосточный государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор Степанова Татьяна Алексеевна

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор Фурса Николай Сергеевич

ГБОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

доктор фармацевтических наук, профессор Кудашкина Наталья Владимировна

ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Пятигорская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита диссертации состоится «19» июня 2012 г. в 13 часов
на заседании Диссертационного совета Д 208.068.01 при ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Полевая, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО ПГФА Минздравсоцразвития России по адресу: 614070, г. Пермь, ул. Крупской, 46.

Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте Министерства образования и науки Российской Федерации http://www.mon.gov.ru « » _______ 2012 г. и на сайте ГБОУ ВПО ПГФА Минздравсоцразвития России http://pfa.ru « » _________ 2012 г.

Автореферат разослан «___» 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 208.068.01

кандидат фармацевтических наук, доцент И.А. Липатникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одним из перспективных направлений применения лекарственных средств растительного происхождения является лечение хронических заболеваний, так как фитопрепараты обеспечивают безопасность терапии, а поливалентность химического состава позволяет использовать их для компенсации патологических процессов, сопутствующих основному заболеванию. Ряд вторичных метаболических и патофизиологических нарушений, возникающих при сахарном диабете, обосновывает актуальность использования лекарственных растений при данном заболевании.

Необходимость поиска новых фитопрепаратов для лечения сахарного диабета определяется уровнем заболеваемости и смертности в результате болезни, а также недостаточным ассортиментом гипогликемических лекарственных средств растительного происхождения. В связи с этим на кафедре фармакогнозии и ботаники ДВГМУ разработан состав сбора противодиабетического.

В последнее время все большее внимание уделяется разработке готовых к употреблению препаратов из растительного сырья. Создание таких препаратов позволяет увеличить выход биологически активных веществ (БАВ) из сырья и соответственно увеличить их процентную концентрацию в фитопрепарате, а также повысить терапевтический эффект за счет точности дозирования. Кроме того, при использовании готовых лекарственных форм обеспечивается удобство применения и хранения. К распространенным готовым лекарственным формам относятся жидкие экстракты, которые не потеряли актуальности и в современных условиях.

Разработка нового лекарственного препарата влечет за собой необходимость решения задач стандартизации. Наиболее сложной является стандартизация многокомпонентных средств, к которым относится разработанное в ДВГМУ оригинальное средство для лечения сахарного диабета. Современная система контроля качества лекарственных средств предъявляет к разработчикам все более жесткие требования по стандартизации, поэтому разработка подходов, позволяющих надежно оценить качество препарата, представляет научно-практический интерес.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является разработка способа получения и метода стандартизации оригинального экстракта жидкого противодиабетического.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• изучить качественное и количественное содержание основных биологически активных веществ в экстракте и сравнить с выходом БАВ в настой;
• изучить влияние технологических факторов на качество получаемого экстракта и определить оптимальную концентрацию спирта этилового, размер частиц и способ закладки сырья в перколяторы;
• установить показатели подлинности и доброкачественности экстракта;
• разработать методику количественного определения флавоноидов в экстракте;
• обосновать нормативные показатели качества экстракта;
• изучить влияние продолжительности хранения на содержание БАВ в экстракте, обосновать сроки хранения экстракта;
• определить с помощью метода математического планирования оптимальный способ получения экстракта.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований Дальневосточного государственного медицинского университета (№ государственной регистрации 01.200 309930). Тема работы утверждена на заседании научно-плановой комиссии ДВГМУ (Протокол № 11 от 19.11.2003 г.).

Научная новизна. Впервые разработан оптимальный способ получения оригинального противодиабетического фитопрепарата в форме жидкого экстракта. С использованием современных методов анализа изучен качественный состав и количественное содержание БАВ экстракта. Установлен элементный состав препарата. Разработана спектрофотометрическая методика количественного определения флавоноидов и ВЭТСХ методика (высокоэффективная тонкослойная хроматография) определения подлинности экстракта. Установлены нормативные показатели качества экстракта. Исследованы изменения в количественном содержании пяти групп БАВ в процессе хранения препарата. Показано влияние числа ступеней экстракции на показатель «сухой остаток» и продолжительности экстрагирования на себестоимость экстракта.

Практическая значимость работы. Разработан способ получения стандартного продукта при минимальных экономических затратах. Разработаны методики анализа для контроля качества препарата при его серийном производстве.

Обоснованы показатели подлинности и доброкачественности экстракта противодиабетического, а также сроки хранения, включенные в проект Фармакопейной статьи предприятия (ФСП).

Результаты работы апробированы в ГУЗ «Центр контроля качества и сертификации лекарственных средств» Министерства здравоохранения Хабаровского края» и внедрены в учебный процесс кафедры фармакогнозии и ботаники Дальневосточного государственного медицинского университета, а также кафедры фармацевтической технологии и биотехнологии с курсом ФПК и ППС Владивостокского государственного медицинского университета.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на 60-й, 62-й и 63-й итоговых научных конференциях студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы современной медицины» (Хабаровск, 2004; 2005; 2006 гг.); региональной научно-практической конференции «Организация лекарственного обеспечения рациональной фармакотерапии в условиях реализации национального проекта в Дальневосточном Федеральном округе» (Хабаровск, 2008 г), межкафедральной научной конференции (Хабаровск, 2009 г.); конференции, посвященной 45-летию фармацевтического факультета ДВГМУ «Дальневосточная фармация – основные тенденции развития» (Хабаровск, 10-11 сентября 2009 г); XIII краевом конкурсе молодых ученых и аспирантов (Хабаровск, 20 января 2011 г).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК для публикации результатов диссертационных исследований.

Личный вклад автора. Автором диссертационного исследования самостоятельно проведены представленные в работе эксперименты, включая подготовку исследуемых образцов к анализу, работу на аналитическом оборудовании, анализ полученных данных с использованием методов математической статистики. При непосредственном участии автора проведено сопоставительное изучение химического состава экстракта противодиабетического и изученных ранее лекарственных форм – сбора и настоя. Проведены эксперименты по определению оптимальных технологических параметров экстрагирования лекарственного растительного сырья. Разработан метод стандартизации экстракта. Определены нормативные показатели. Выполнен статистический анализ результатов. Проведена валидация методик стандартизации препарата. Разработан проект ФСП на экстракт. А также разработан и экономически обоснован способ получения нового фитопрепарата.

Основные положения, выносимые на защиту: результаты сравнительного изучения качественного состава и количественного содержания действующих веществ в экстракте и настое; результаты изучения влияния технологических факторов на выход БАВ в экстракт; обоснование методик определения подлинности экстракта и количественного содержания флавоноидов в препарате; обоснование норм качества экстракта; результаты изучения влияния сроков хранения экстракта на содержание действующих веществ; результаты оптимизации способа получения экстракта.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 172 страницах машинописного текста, иллюстрирована 29 рисунками и 52 таб­лицами. Результаты экспериментов обработаны статистически.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, четырех глав экспериментальной работы, общих выводов, списка литературы и приложений. Список литературы включает 243 источника из них 38 на иностранных языках.

Во введении раскрыта актуальность темы, определены цели и задачи исследования, сформулированы научная новизна и практическая значимость работы.

В главе I (литературный обзор) приводятся сведения по изучению влияния технологических факторов на процессы массопередачи веществ при экстрагировании лекарственного растительного сырья (ЛРС). А также рассмотрено использование веществ-маркеров для разработки методов стандартизации многокомпонентных препаратов растительного происхождения.

В главе II охарактеризованы основные объекты исследования и приведены методы анализа, использованные в экспериментах.

В главе III приведены результаты фитохимического исследования экстракта и настоя, полученных по одной прописи.

Глава IV посвящена изучению факторов, интенсифицирующих процесс экстрагирования лекарственного растительного сырья.

В главе V описаны исследования по разработке методик подтверждения подлинности экстракта и количественного определения флавоноидов в препарате. Приведены нормативные показатели. Даны результаты исследования по изучению изменчивости содержания БАВ в экстракте в процессе хранения и результаты изучения микробиологической чистоты препарата.

Глава VI посвящена оптимизации способа получения экстракта противодиабетического.

Приложение 1 содержит проект ФСП на экстракт противодиабетический. В приложение 2 включены графические результаты по оптимизации способа получения экстракта. В приложение 3 включен отчет по изучению гипогликемической активности экстракта противодиабетического. В приложение 4 включены акты внедрения.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Основной объект исследования ­– экстракт противодиабетический. Для его получения использовали сырье, собранное на Дальнем Востоке: черника обыкновенная, брусника, леспедеца двухцветная, крапива узколистная, шиповник даурский, калина Саржента. Экстракт получали методом реперколяции в соотношении растительного сырья и готового продукта 1:1. В качестве экстрагента использовали спирт этиловый. Измельчение лекарственного растительного сырья проводили на мельнице ножевой РМ–120.

Химический состав экстракта изучали с использованием современных методов фитохимического анализа. Высокоэффективную тонкослойную хроматографию (ВЭТСХ) проводили с помощью систем для тонкослойной хроматографии "Camag" и "Sorbfil" на пластинках Kieselgel 60 F254 (Merk) и ПТСХ-П-В-УФ (Sorbfil). Высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) проводили с использованием хроматографа "Agilent Technologies 1100 Series".

В качестве стандартных образцов веществ сравнения (COВС) использовали ГСО и РСО флавоноидов, фенольных соединений, сахаров, органических и оксикоричных кислот.

Определение элементного состава проводили с помощью масс-спектрометра с индуктивно-связанной плазмой IСP-MS Elan DRC II PerkinElmer (США).

Количественное определение полисахаридов, дубильных веществ, органических кислот, суммы фенольных соединений, флавоноидов и арбутина проводили по фармакопейным и оригинальным методикам (спектрофотометрическим и хроматографическим). Спектрофотометрические исследования выполняли на спектрофотометре UV-1700 (Shimadzu).

Обоснование возможности разработки готовой лекарственной формы на основе прописи сбора противодиабетического

Для обоснования перспективности разработки экстракта по противодиабетической прописи проводили изучение его химического состава и дальнейшее сопоставление биологически активных комплексов экстракта и настоя.

Были определены основные группы БАВ: флавоноиды, дубильные вещества, простые фенолы, сапонины, полисахариды. Дальнейший анализ химического состава экстракта проводили с помощью ВЭТСХ.

Применение хроматографических методов позволило подтвердить присутствие в экстракте веществ флавоноидной природы, простых фенольных соединений, органических кислот, моносахаров и идентифицировать некоторые индивидуальные вещества – рутин, гиперозид, кверцетин, кемпферол, хлорогеновую, кофейную и галловую кислоты, арбутин, гидрохинон, яблочную, аскорбиновую, янтарную, бензойную и салициловую кислоты, глюкозу, фруктозу, галактозу. Всего в экстракте идентифицировано 17 индивидуальных веществ.

Сопоставление хроматографических профилей сравниваемых лекарственных форм противодиабетического состава показало хорошее совпадение пиков доминирующих веществ. Коэффициент корреляции относительных величин, характеризующих площадь пиков в хроматограммах экстракта и настоя, равен 0,92.

Сравнение экстемпоральной и готовой лекарственных форм проводили также по количественному содержанию флавоноидов, дубильных и экстрактивных веществ (табл. 1).

Таблица 1

Содержание БАВ и экстрактивных веществ в настое (1:40) и экстракте противодиабетическом (1:1), %

Вещества	Показатели настоя		Показатели экстракта
	абс. содержание	отн. содержание (выход)	абс. содержание	отн. содержание (выход)
экстрактивные	0,56	60	25,90	71
флавоноиды	0,01	47	0,5	56
дубильные	0,11	59	6,09	71

Результаты анализа свидетельствуют о преимуществе экстракта по выходу указанных веществ.

Кроме суммы веществ, в настое и экстракте количественно оценивали содержание рутина и гиперозида. Определение проводилось методом ВЭЖХ. При сравнении выхода флавоноидов в настой и экстракт (табл. 2), было также отмечено преимущество экстракта перед настоем по выходу рутина и гиперозида почти в 2 раза.

Таблица 2

Содержание рутина и гиперозида в настое и экстракте

Лекарственная форма	БАВ	Содержание в сырье, мг/г	Содержание в препарате, мг/мл	Выход, %
настой	рутин	0,053	0,00051	15,47
	гиперозид	0,92	0,0071	13,04
экстракт	рутин	0,053	0,015	28,30
	гиперозид	0,92	0,26	28,26