Разработка методик определения дицикловерина гидрохлорида и тропикамида в моче для целей химико-токсикологического анализа

Предложенная методика изолирования позволяет выделить в зависимости от концентрации 81,63 – 86,98% дицикловерина гидрохлорида из 10 мл мочи (относительная ошибка определения 3,59 – 4,72).

Предел обнаружения дицикловерина гидрохлорида в моче по данной методике составляет 0,05 мкг/мл. Предел количественного определения 0,1 мкг/мл.

Таблица 5 – Результаты количественного определения тропикамида в модельных смесях мочи методом ВЭЖХ

Концентрация тропикамида в модельной смеси, мкг/мл	Метрологические характеристики (n=5, t=2,78)
		S	S	х
1,0	73,81%	3,31	1,48	9,20	4,11	12,46	5,57
1,5	75,25%	3,14	1,40	8,73	3,90	11,60	5,18
2,0	76,33%	3,01	1,34	8,37	3,74	10,97	4,90
5,0	78,13%	2,54	1,15	7,06	3,15	9,04	4,03

Процент экстракции тропикамида из мочи в зависимости от концентрации составляет 73,81 – 78,13% (относительная ошибка определения 4,03 – 5,57).

Предел обнаружения тропикамида – 0,08 мкг/мл, предел количественного определения 0,1 мкг/мл.

3. Схемы химико-токсикологического исследования мочи на наличие дицикловерина гидрохлорида и тропикамида

На основании проведенных экспериментальных исследований по разработке условий изолирования, обнаружения и количественного определения предложены следующие схемы химико-токсикологического анализа дицикловерина гидрохлорида и тропикамида в моче (рис. 12 и 13).

Комплекс разработанных методик апробирован на экспертном материале, поступившем на исследование в ХТЛ Пермского краевого наркодиспансера.

Рис. 12 – Схема химико-токсикологического исследования мочи на наличие дицикловерина гидрохлорида

В исследованных реальных пробах мочи (5 образцов) содержание дицикловерина гидрохлорида варьировалось в диапазоне концентраций от 0,22 до 2,30 мкг/мл.

Рис. 13 – Схема химико-токсикологического исследования мочи на наличие тропикамида

В разработанных условиях исследовали 10 образцов мочи лиц, употребляющих тропикамид с немедицинскими целями. Содержание тропикамида в данных пробах находилось в диапазоне концентраций от 0,5 до 5,90 мкг/мл.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны методики предварительного обнаружения дицикловерина гидрохлорида и тропикамида в экстрактах из мочи методом тонкослойной хроматографии для этапа скрининговых исследований: выбраны оптимальные системы растворителей, предложена поэтапная схема детектирования, определена чувствительность используемых детектирующих агентов по отношению к определяемым веществам.
2. Предложены условия совместного определения тропикамида и опиатов в моче методом тонкослойной хроматографии в частной системе этилацетат–метанол–25% раствор аммиака 17:2:1.
3. Для этапа подтверждающих исследований разработаны методики идентификации дицикловерина гидрохлорида и тропикамида в извлечениях из биожидкости с использованием современных инструментальных методов.
4. Выбраны оптимальные условия анализа исследуемых веществ методом газо-жидкостной хроматографии на приборах «Кристалл 2000М» с термоионным детектором и Agilent 7890A с масс-спектрометрическим детектором. Изученные газохроматографические и масс-спектральные характеристики веществ могут быть применены для их идентификации. Установлена необходимость предварительной дериватизации тропикамида и предложены схемы ацилирования уксусным и пентафторпропионовым ангидридом.
5. Для количественного определения дицикловерина гидрохлорида предложен метод газо-жидкостной хроматографии на приборе «Кристалл 2000М» с использованием внутреннего стандарта – дифениламина.
6. Для идентификации и количественного определения тропикамида предложен метод ВЭЖХ на приборе «Милихром А-02» со спектрофотометрическим детектированием. Выбраны оптимальные условия хроматографирования и приведены параметры идентификации. Для количественного анализа предложен метод абсолютной калибровки.
7. Установлены валидационные характеристики предложенных методик по показателям специфичность, линейность, воспроизводимость, пределы обнаружения и количественного определения.
8. На основании изучения условий экстракции дицикловерина гидрохлорида и тропикамида из водных растворов органическими растворителями разработаны методики извлечения исследуемых веществ из мочи на основе жидкость-жидкостной экстракции. Установлено, что оптимальными экстрагентом для дицикловерина гидрохлорида является хлороформ при рН 2, для тропикамида – хлороформ при рН 9. Разработанные методики в зависимости от концентрации позволяют выделить 81,63-86,98% дицикловерина гидрохлорида и 73,81-78,13% тропикамида.
9. Показана эффективность извлечения тропикамида из мочи смесью хлороформ-бутанол (6:1) при рН 9-10 в случае совместного присутствия в пробе с опиатами. Процент экстракции тропикамида – 71,60%.
10. Составлены схемы химико-токсикологического исследования мочи на наличие дицикловерина гидрохлорида и тропикамида.
11. Оценена пригодность разработанных методик обнаружения и количественного определения изучаемых веществ в практике химико-токсикологического анализа путем их апробации на реальных образцах мочи, поступивших на исследование в химико-токсикологическую лабораторию ГБУЗ «Пермский краевой наркологический диспансер» на наличие дицикловерина гидрохлорида и тропикамида.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Тумилович, Е.Ю. Определение компонентов препарата Триган Д в моче при химико-токсикологическом анализе / Е.Ю. Тумилович, Ю.Н. Карпенко, О.Н. Дворская // Наркология. – 2010. – №9. – С. 46-51.
2. Химико-токсикологическое исследование мочи на наличие тропикамида / Е.Ю. Тумилович, Ю.Н. Карпенко, Л.Н. Курдина, О.Н. Дворская, Н.Ю. Порсева // Наркология. – 2011. – №10. – С. 64-69.
3. О проблеме немедицинского использования лекарственного препарата тропикамид в Пермском крае / О.Н. Дворская, Ю.Н. Карпенко, Е.Ю. Тумилович, Н.Ю. Порсева // Медицинская экспертиза и право. – 2011. – №1. – С. 17-19.
4. Применение холинолитиков в немедицинских целях / Н.Ю. Порсева, А.В. Солонинина, О.Н. Дворская, Ю.Н. Карпенко, Е.Ю. Тумилович // Фармация. – 2012. – №2. – С. 51-53.
5. Тумилович, Е.Ю. Метод газожидкостной хроматографии в анализе препарата Триган Д / Е.Ю. Тумилович, М.И. Фомина Ю.Н. Карпенко // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. – 2009. №5. – С. 160-162.
6. Тумилович, Е.Ю. Разработка методик хроматографического анализа для определения дицикловерина в биожидкостях / Е.Ю. Тумилович, Ю.Н. Карпенко, О.Н. Дворская // Тезисы докладов Межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых «Фармация в XXI веке: эстафета поколений» (23-24 апреля 2009 г) / СПб. : Издательство СПХФА, 2009. – С. 62-63.
7. Тумилович, Е.200Ю. Изучение условий экстракции дицикловерина гидрохлорида из водных растворов органическими растворителями / Е.Ю. Тумилович, Ю.Н. Карпенко // Материалы Российской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы судебно-химических, химико-токсикологических исследований и фармацевтического анализа» (28 сентября – 3 октября 2009 г). – Пермь, 2009. – С. 97-99.
8. Тумилович, Е.Ю. Выбор условий дериватизации тропикамида для исследования методом газо-жидкостной хроматографии / Е.Ю. Тумилович, А.С. Богданова, И.П. Крохин, Ю.Н. Карпенко // Сборник материалов 74-ой итоговой студенческой научно-практической конференции с международным участием, посвященной 100-летию со дня рождения проф. А.М. Дыхно (20-23 апреля 2010 г). – Красноярск, 2010. – С. 882-885.
9. Тумилович, Е.Ю. Использование газо-жидкостной хроматографии с масс-селективным детектированием в анализе дицикловерина и тропикамида / Е.Ю. Тумилович, А.С. Богданова, И.П. Крохин, Ю.Н. Карпенко // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. – 2010. – №6. – С. 194-196.
10. Тумилович, Е.Ю. Высокоэффективная жидкостная хроматография в анализе Тропикамида / Е.Ю. Тумилович, Ю.Н. Карпенко // Материалы межрегиональной научно-практической конференции с международным участием, посвященной 75-летию судебно-медицинской службы в Кировской обл. «Актуальные вопросы судебно-медицинской науки и практики». – Киров, 2010. – С. 436-438.
11. Тумилович, Е.Ю. Метод тонкослойной хроматографии в анализе тропикамида / Е.Ю. Тумилович, Е.В. Крылова, Ю.Н. Карпенко // Сборник тезисов 85-ой Всероссийской студенческой научной конференции памяти академика АН РТ, проф. Д.М. Зубаирова (15-16 апреля 2011 г). – Казань, 2011. – С. 350.
12. Тумилович, Е.Ю. Определение оптимальных условий обнаружения тропикамида в биологических жидкостях методом тонкослойной хроматографии / Е.Ю. Тумилович, Е.В. Крылова, Ю.Н. Карпенко, О.Н. Дворская // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. – 2011. – №8. – С. 133-134.
13. Тумилович, Е.Ю. Использование базы данных «БД-2003» в анализе тропикамида методом высокоэффективной жидкостной хроматографии / Е.Ю. Тумилович, Ю.Н. Карпенко, О.Н. Дворская // Материалы научно-практической конференции с международным участием, посвященной 75-летию ПГФА «Актуальные проблемы науки фармацевтических и медицинских ВУЗов: от разработки до коммерциализации» (7-9 декабря 2011 г). – Пермь, 2011. – С. 162-164.

Тумилович Екатерина Юрьевна (Россия)

Разработка методик определения дицикловерина гидрохлорида и тропикамида в моче для целей химико-токсикологического анализа

Разработаны методики предварительного обнаружения дицикловерина гидрохлорида и тропикамида в экстрактах из мочи методом тонкослойной хроматографии для этапа скрининговых исследований. Предложены условия совместного определения тропикамида и опиатов в моче методом ТСХ в частной системе для опиатов. Для этапа подтверждающих исследований разработаны методики идентификации дицикловерина гидрохлорида и тропикамида в извлечениях из биожидкости с использованием современных инструментальных методов (ГЖХ, ВЭЖХ, ГХ/МС). Для количественного определения дицикловерина гидрохлорида предложен метод газо-жидкостной хроматографии на приборе «Кристалл 2000М» с использованием внутреннего стандарта – дифениламина. Для количественного определения тропикамида предложен метод ВЭЖХ на приборе «Милихром А-02» со спектрофотометрическим детектированием. Разработаны методики извлечения исследуемых веществ из мочи на основе жидкость-жидкостной экстракции. Составлены схемы химико-токсикологического исследования мочи на наличие дицикловерина гидрохлорида и тропикамида.

Tumilovich Ekatherina (Russia)

Development of methods for determining dicycloverine hydrochloride and tropicamide in the urine for targets of chemical-toxicological analysis

The techniques of the prior detection of dicycloverine hydrochloride and tropicamide in extracts from the urine by thin layer chromatography for the screening stage were developed. The conditions for the simultaneous determination of tropicamide and opiates in urine by TLC in a private system for opiates were proposed. For the stage of confirmatory studies various techniques have been developed to identify dicycloverine hydrochloride and tropicamide in extracts from biological liquid using modern instrumental methods (GC, HPLC, GC/MS). For the quantitative determination of dicycloverine hydrochloride the gas-liquid chromatography using an internal standard – diphenylamine was suggested. For the quantitative determination of tropicamide HPLC method on the device "Milichrome A-02" with spectrophotometric detection was proposed. The techniques of extraction of the target substances from urine by liquid-liquid extraction were developed. Schemes of chemical-toxicological investigation of urine for the presence of dicycloverine hydrochloride and tropicamide were made.