Разработка методик определения дицикловерина гидрохлорида и тропикамида в моче для целей химико-токсикологического анализа

Полученные результаты свидетельствуют о том, что исследуемые вещества имеют удовлетворительные значения Rf во всех выбранных системах на обоих видах пластинок «Сорбфил». Значения Rf дицикловерина гидрохлорида и парацетамола указывают на их хорошее разделение в данных системах в случае совместного присутствия в биологических пробах.

С целью выбора оптимального способа детектирования зон адсорбции дицикловерина гидрохлорида, тропикамида и парацетамола на хроматографических пластинках было изучено отношение исследуемых веществ к ряду потенциальных детектирующих агентов: УФ-свет (254, 365 нм), реактивы Драгендорфа (модифицированный по Мунье), Манделина, Марки, Фреде, железа (III) хлорида раствор 30%, реактив FPN, меди сульфата и калия йодида растворы 1 моль/л, меди сульфата раствор 10% и аммиака раствор 2% в соотношении 5:1.

По результатам исследований оптимальным способом детектирования тропикамида является облучение пластинки УФ-светом при длине волны 254 нм с последующим опрыскиванием реактивом Драгендорфа.

Оптимальный способ детекции компонентов препарата «Триган Д» заключается в поэтапной обработке хроматограммы:

• облучением в УФ–свете (254 нм) – наблюдается зона поглощения темно-синего цвета (парацетамол);
• раствором железа (III) хлорида 30% – обнаруживается парацетамол в виде пятна синего цвета;
• реактивом Драгендорфа – дицикловерин обнаруживается в виде пятна оранжево-коричневого цвета, окраска пятна парацетамола переходит из синей в оранжево-коричневую.

Предел обнаружения тропикамида при облучении УФ-светом составляет 1 мкг, при детектировании реактивом Драгендорфа – 0,5 мкг вещества в наносимом пятне.

При обработке реактивом Драгендорфа дицикловерина гидрохлорид обнаруживался при содержании в пятне 1 мкг и выше (предел обнаружения – 1 мкг).

Анализ статистических данных указывает на то, что в биопробах тропикамид часто встречается в виде комбинации с опиатами. Поэтому нами была определена возможность идентификации тропикамида совместно с морфином в частной системе для опийных алкалоидов. Поэтапная детекция компонентов осуществлялась путем обработки пластинки УФ-светом при 254 нм (отмечали зоны поглощения темно-синего цвета в зонах расположения тропикамида и морфина), далее пластины обрабатывали реактивами Марки и Фреде. При этом морфин детектировался в виде пятен красно-фиолетового цвета и сине-фиолетового цвета соответственно с Rf 0,20±0,02. После обработки пластины реактивом Драгендорфа визуализировались зоны адсорбции морфина и тропикамида в виде оранжево-коричневых пятен с Rf 0,20±0,02 и 0,69±0,03.

Газо-жидкостная хроматография

Исследования по установлению оптимальных условий газохроматографического определения дицикловерина гидрохлорида на хроматографе «Кристалл 2000М» сводились к выбору типа колонки (НЖФ), способа детектирования и режима программирования температуры анализа.

На основе проведенных исследований были выбраны следующие условия анализа (рис. 1):

• колонка НР-5 (30 м 0,25 мм);
• детектор – термоионный;
• температурный режим: температура детектора 280 °С; температура испарителя 260 °С; температура колонки программируемая: 160 °С – 2 минуты, подъем до 240 °С со скоростью 20 °С в минуту, далее до конца анализа температура без изменений;
• газ-носитель – азот;
• скорость потока газа через колонку – 1,50 мл/мин.;
• вспомогательные газы: водород, воздух;
• объем вводимой пробы – 1 мкл;
• время хроматограммы – 10 минут.

Рис. 1 – Хроматограмма стандартного раствора дицикловерина гидрохлорида (10 мкг/ мл) в метаноле на колонке НР-5 (детектор ТИД)

В данных условиях дицикловерина гидрохлорид элюируется в виде симметричного пика со временем удерживания – 7,7±0,1 мин. Для проверки специфичности предложенных условий анализировались экстракты из модельных смесей дицикловерина гидрохлорида и мочи (10 мкг/мл), а также экстракт холостой пробы мочи. Установлено, что в выбранных условиях наблюдается четкое разделение пика исследуемого вещества и пиков соэкстрактивных веществ (коэффициент разделения пика дицикловерина гидрохлорида и ближайшего пика на хроматограмме Rs=3,6).

Для количественного определения дицикловерина в экстрактах из мочи предложен метод внутреннего стандарта. В качестве внутреннего стандарта выбран дифениламин, поскольку он хорошо разделяется с анализируемым веществом в разработанных условиях, имеет близкое время удерживания и не является объектом злоупотребления. Помимо этого дифениламин хорошо растворяется в метаноле и хлороформе, которые используются на различных этапах пробоподготовки объекта к анализу.

Для построения калибровочного графика готовили модельные смеси мочи с содержанием дицикловерина от 1 до 25 мкг в пробе (10 мл). В каждую пробу добавляли 25 мкг дифениламина. Экстракты анализировали методом ГЖХ. Пример калибровочной хроматограммы и градуировочный график количественного определения дицикловерина приведены на рис. 2 и 3.

Зависимость между концентрацией растворов и соотношением площадей хроматографических пиков дицикловерина и дифениламина описывается уравнением Sв-ва/Sвн.ст.=0,045c. Линейность градуировочного графика наблюдается во всем интервале выбранных концентраций (коэффициент корреляции составляет 0,999). Чувствительность метода – 1 нг во вводимой пробе (1 мкл).

Рис. 2 – Пример калибровочной хроматограммы модельной смеси мочи, содержащей дицикловерина гидрохлорид и внутренний стандарт

Рис. 3 – Градуировочный график количественного определения дицикловерина гидрохлорида методом внутреннего стандарта

При исследовании тропикамида методом газовой хроматографии в различных условиях были получены ассиметричные пики с малыми площадями. Это обусловило необходимость подбора условий дериватизации тропикамида для улучшения его хроматографических характеристик и увеличения чувствительности метода.

Поскольку тропикамид содержит в своей структуре свободную гидроксильную группу, были предложены схемы дериватизации ацилированием с помощью уксусного и пентафторпропионового ангидрида. Газохроматографическое определение вели в условиях, разработанных для дицикловерина гидрохлорида.

Установлено, что образующиеся дериваты имеют более симметричную форму хроматографического пика. Производное тропикамида с ПФПА имеет время удерживания – 8,68±0,2 минуты, производные тропикамида и уксусного ангидрида – 11,96±0,2 мин. Чувствительность метода составила 3 нг во вводимой пробе (1 мкл) для пентафторпропионового производного тропикамида, и 5 нг – для ацетильного производного.

Газовая хроматография с масс-селективным детектированием

Исследования проводились на газовом хроматографе Agilent 7890A с масс-спектрометрическим детектором Agilent 5975С на капиллярной неполярной колонке НР-5МS. Ввод пробы (1 мкл) осуществлялся автоматически без деления потока газа-носителя. Масс-детектор работал в режиме сканирования спектров электронного удара при 70 эВ в интервале от 50 до 550 а.е.м.

При разработке методики варьировали скорость потока газа-носителя, температурные режимы инжектора и хроматографической колонки. Предложены следующие условия анализа методом ГХ/МС:

• Скорость потока газа-носителя (гелий) – 1 мл/мин.
• Ввод пробы производится автоматически без деления потока газа-носителя.
• Температура инжектора – 250 °С.
• Температура интерфейса – 320 °С.
• Температурная программа колонки: начальная температура – 70 °С (выдержка 5 минут), повышение температуры со скоростью 10 °С/мин. до 320 °С с выдержкой при конечной температуре 8 минут.

Время удерживания дицикловерина гидрохлорида составило 14,00±0,10 мин. (рис. 4).

Рис. 4 – Хроматограмма по полному ионному току стандартного раствора дицикловерина гидрохлорида в метаноле (10 мкг/мл)

Масс-спектр дицикловерина гидрохлорида приведен на рисунке 5. Характеристические ионы в масс-спектре дицикловерина гидрохлорида: 86, 99, 71, 83 m/z (данные приведены в порядке уменьшения m/z).

Рис. 5 – Масс-спектр дицикловерина гидрохлорида

При анализе тропикамида методом ГХ/МС необходима предварительная дериватизация. Пентафторпропионовое производное тропикамида имеет время удерживания 15,2±0,10 мин., ацетильное производное тропикамида – 17,3±0,15 мин. (рис. 6 и 7). Хроматомасс–спектрометрические характеристики дериватов тропикамида представлены в таблице 2.

Рис. 6 – Хроматограмма пентафторпропионового производного тропикамида (режим Scan)

200

Рис. 7 – Хроматограмма ацетильного производного тропикамида (режим Scan)

Таблица 2 – Хроматомасс-спектрометрические характеристики дериватов тропикамида

Дериватизирующие агенты
Пентафторпропионовый ангидрид и пентафторпропанол		Уксусный ангидрид и этилацетат
м/z	Относительная интенсивность характеристического иона, %	м/z	Относительная интенсивность характеристического иона, %
92	100	92	100
163	45,9	104	31,2
119	12,4	163	21,1
266	18,0	266	19,6
65	9,3	65	9,5

Высокоэффективная жидкостная хроматография

Наличие хромофорных групп в структуре тропикамида обусловило возможность его анализа методом ВЭЖХ со спектрофотометрической детекцией. Разработку методики идентификации и количественного определения тропикамида проводили на микроколоночном жидкостном хроматографе «Милихром А-02».

Аналитическую длину волны детектирования подбирали, исходя из анализа УФ-спектра тропикамида. В спектре аналита максимум поглощения наблюдается при 254 нм. Однако в исследованиях в качестве рабочей нами была выбрана длина волны 210 нм, при использовании которой чувствительность метода значительно повышается (рис. 8).

Рис. 8 – УФ-спектр стандартного раствора тропикамида (100 мкг/мл), снятый в режиме обзорного хроматографирования

По результатам исследований выбраны следующие условия хроматографического определения тропикамида на основе градиентного элюирования:

• неподвижная фаза «ProntoSIL 120-5 С18». Диаметр зерен сорбента – 5 мкм;
• подвижная фаза: перхлоратный буфер – ацетонитрил;
• скорость потока элюента – 100 мкл/мин;
• режим элюирования – градиентный: градиент от 10% до 85% ацетонитрила за 10 мин;
• объем вводимой пробы – 4 мкл;
• детектирование многоволновое при 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280 и 300 нм;
• температура колонки – 35°С.

Время удерживания тропикамида в данных условиях составляет 8,15 минуты (рис. 9).

Рис. 9 – Хроматограмма стандартного раствора тропикамида (100 мкг/мл) при градиентном режиме элюирования

Для установления специфичности разработанных условий и пригодности их использования в анализе биообъектов анализировались экстракты из модельных смесей мочи с тропикамидом и экстракты холостых проб. В качестве критерия полноты разделения пиков использовали коэффициент разделения пиков Rs. Установлено, в разработанных условиях тропикамид элюируется в виде симметричного пика, а пики соэкстрактивных веществ не мешают определению исследуемого аналита (рис.10).

Рис. 10 – Хроматограмма экстракта из модельной смеси мочи и тропикамида

В таблице 3 приведены хроматографические параметры тропикамида и оценена их приемлемость.

Таблица 3 – Параметры пригодности хроматографической системы

Вещество	Время удерживания*, мин.	Коэффициент емкости	Коэффициент разделения пиков Rs	Коэффициент асимметрии	Эффектив-ность колонки (N)
тропикамид	8,15±0,25	4,1	2,4	1,11	18758 тт
		Критерий приемлемости: [2-10]	Критерий приемлемости:не менее 2	Критерий приемлемости:0,8 – 1,5	Критерий приемлемости:более 2000

*- расчет проводился по 5 хроматограммам раствора

Чувствительность метода составила 1,2 нг во вводимой пробе (4 мкл).

Для определения тропикамида в моче нами был построен градуировочный график с использованием модельных смесей мочи с содержанием тропикамида от 1 до 25 мкг в пробе (10 мл) (рис. 11).

Рис. 11 – Градуировочный график количественного определения тропикамида в моче методом абсолютной калибровки

Установлено, что линейность отклика детектора соблюдается в выбранном диапазоне концентраций. Уравнение линейной зависимости имеет вид S=0,236c, коэффициент корреляции составляет 0,993.

2. Изолирование дицикловерина гидрохлорида и тропикамида

из мочи

Для разработки оптимального метода изолирования исследуемых веществ из мочи нами предварительно были изучены условия экстракции дицикловерина гидрохлорида и тропикамида органическими растворителями из водных растворов. Исследовано влияние на процесс экстракции аналитов следующих факторов: природы органического растворителя и pH буферного раствора.

В качестве экстрагентов применяли следующие органические растворители: диэтиловый эфир, хлороформ, метиленхлорид и смеси хлороформ-изопропанол 9:1. Для создания определенного значения pH в растворе использовали универсальные буферные смеси Бриттона-Робинсона.

Установлено, что при использовании любого из выбранных органических растворителей дицикловерина гидрохлорид имеет высокую степень экстракции (от 50% до 100%) в широком диапазоне рН (от 3 до 12), что может быть обусловлено высоким сродством исследуемого вещества к органической фазе (коэффициент распределения Log Pоктанол/вода равен 3,98).

Поскольку тропикамид часто применяется в сочетании с опиатами, нами в качестве экстрагента апробировалась и смесь хлороформ-бутанол (6:1), широко используемая при экстракции опиатов после гидролиза.

Установлено, что оптимальными экстрагентами для извлечения тропикамида из водных растворов являются хлороформ и смесь хлороформ-бутанол 6:1. При использовании хлороформа максимальный выход тропикамида составляет 93,37% при рН 9; при использовании смеси хлороформ-бутанол (6:1) извлекается до 90,11% вещества при рН 10.

Путем эксперимента на модельных смесях анализируемых веществ и мочи было установлено, что максимальное извлечение дицикловерина достигается хлороформом при рН 2 (87,61%), тропикамида – хлороформом (86,35%) при рН 9 и смесью хлороформ-бутанол в соотношении 6:1 (71,60%).

По результатам проведенных исследований предложены следующие методики изолирования дицикловерина гидрохлорида и тропикамида из мочи:

Методика изолирования дицикловерина гидрохлорида: 10 мл мочи помещают в стеклянный флакон с навинчивающейся крышкой вместимостью 30 мл. Мочу подкисляют до рН 2 по универсальному индикатору хлористоводородной кислотой разведенной и добавляют 5 мл хлороформа. Содержимое флакона взбалтывают в течение 5 минут на механическом встряхивателе при 150 об/мин. Затем смесь из флакона переносят в делительную воронку, оставляют на 2-3 минуты для расслоения и фильтруют органическую фазу через бумажный фильтр с безводным натрия сульфатом в сухой чистый пенициллиновый флакон. Экстракцию проводят дважды. Фильтр промывают 0,5 мл хлороформа, хлороформное извлечение выпаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 1000 мкл метанола, центрифугируют при 10000 об/мин. в течение 5 минут и подвергают дальнейшему исследованию.

Методика изолирования тропикамида: 10 мл мочи помещают в стеклянный флакон с навинчивающейся крышкой вместимостью 30 мл, прибавляют 25% водный раствор аммиака до рН 9-10 и экстрагируют двукратно хлороформом (порциями по 5 мл). Время каждой экстракции – 5 минут. Органическую фазу отделяют в делительной воронке и фильтруют через бумажный фильтр с безводным сульфатом натрия. Фильтр промывают 0,5 мл экстрагента, полученное извлечение выпаривают досуха, растворяют в 1000 мкл метанола, центрифугируют при 10000 об/мин. в течение 5 минут и подвергают дальнейшему исследованию.

Данные методики были апробированы на модельных смесях мочи с концентрацией анализируемых веществ – 1; 1,5; 2 и 5 мкг/мл. Результаты количественного определения веществ в биожидкости и метрологическая оценка результатов представлены в таблицах 4 и 5.

Таблица 4 – Результаты количественного определения дицикловерина гидрохлорида в модельных смесях мочи методом ГЖХ

Концентрация дицикловерина гидрохлорида в модельной смеси, мкг/мл	Метрологические характеристики (n=5, t=2,78)
		S	S	х
1,0	83,48%	3,16	1,41	8,78	3,92	10,52	4,70
1,5	81,63%	3,10	1,38	8,62	3,85	10,56	4,72
2,0	83,86%	2,82	1,26	7,84	3,50	9,35	4,17
5,0	86,98%	2,51	1,12	6,98	3,12	8,02	3,59