Обращенно-фазный вариант тонкослойной хроматографии в химико-токсикологическом анализе ряда лекарственных средств основного характера

На правах рукописи

Поспелова Анна Анатольевна

ОБРАЩЕННО-ФАЗНЫЙ ВАРИАНТ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ В ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ РЯДА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ОСНОВНОГО ХАРАКТЕРА

14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

Пермь – 2012

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель: кандидат фармацевтических наук, доцент

Малкова Тамара Леонидовна

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор,

Ярыгина Татьяна Ивановна

ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, профессор кафедры фармацевтической химии факультета очного обучения

доктор фармацевтических наук, профессор

Клен Елена Эдмундовна

ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, профессор кафедры фармацевтической химии с курсами аналитической и токсикологической химии

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится «15» января 2013 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 208.068.01 при ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Полевая, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава России по адресу: 614070, г. Пермь, ул. Крупской, 46.

Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте Министерства образования и науки Российской Федерации http://www.mon.gov.ru «__» декабря 2012 г. и на сайте ГБОУ ВПО ПГФА Минздрава России http://pfa.ru «__» декабря 2012 г.

Автореферат разослан «__» декабря 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат фармацевтических наук, доцент И.А. Липатникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В структуре отравлений химической этиологии значительную долю занимают отравления лекарственными средствами. Статистические данные в отношении медикаментов, обнаруживаемых в ходе проведения экспертных исследований, показали преобладание соединений с основными свойствами, что обуславливает необходимость более детального изучения веществ данной группы.

Ввиду сложности клинической интерпретации отравлений в практике химико-токсикологического анализа большое значение имеет использование высокочувствительных методов анализа. Одним из наиболее эффективных методов при проведении скрининга «лекарственных ядов» является хроматография в тонком слое сорбента (ТСХ), достоинствами которой являются доступность, простота выполнения, экспрессность, экономичность, возможность сочетания с другими методами анализа с целью повышения качества и достоверности полученных результатов.

Большинство существующих методик химико-токсикологического анализа на основе ТСХ предполагает использование нормально-фазного (НФ) варианта. Применение в качестве сорбента силикагеля с привитыми алкильными цепочками и полярных элюентов – обращенно-фазной разновидности метода (ОФ ТСХ) в настоящее время недостаточно широкое, хотя этот вариант хроматографии имеет ряд преимуществ, так как химически модифицированный силикагель:

• расширяет диапазон селективности метода ТСХ за счет реализации распределительного механизма удерживания сорбатов в отличие от НФ ТСХ, где основным механизмом является адсорбционный;
• исключает необходимость контроля влажности в отличие от слоев на основе силикагеля или оксида алюминия;
• позволяет разделять алифатические гомологи за счет большего влияния на процесс удерживания площади контакта молекулы в сравнении с НФ ТСХ, обладающей селективностью по отношению к изомерам;
• позволяет уменьшить токсичность аналитической методики ввиду применения в качестве составляющих подвижной фазы водно-спиртовых и водно-ацетонитрильных смесей.

Разновидностью силикагеля с привитыми углеводородными фрагментами является сорбент С18, применение которого в плоскостной хроматографии представлено в меньшей степени в сравнении с колоночной жидкостной хроматографией. Тем не менее, сырье для получения этого сорбента является доступным, что позволяет производить его в количествах промышленного масштаба. Схожесть анизотропных свойств С18 с биологическими мембранами обеспечивает возможность изучения липофильности соединений, кроме того, выраженные неполярные свойства сорбента способствуют удерживанию веществ гидрофобного характера (в виде оснований). Представленные характеристики определяют возможность применения данного сорбента в планарной хроматографии.

С целью оптимизации условий ТСХ-скрининга большого круга соединений необходимо учитывать также влияние соэкстрактивных веществ биоматериала (мочи). Распространенными способами выделения экзотоксикантов из мочи являются жидкость-жидкостная экстракция (ЖЖЭ) и твердо-фазная экстракция (ТФЭ).

В целом, для решения разнообразных аналитических задач в области анализа биоматериала исследователь должен располагать возможностью использования ряда сорбентов, уникальных по свойствам, химии поверхности, технологии получения. Поэтому актуальными являются оценка аналитических возможностей ОФ ТСХ с применением сорбента С18 и разработка скрининговых методик идентификации ряда токсикологически важных веществ.

Целью работы является разработка методик определения ряда токсикологически важных лекарственных средств основного характера методом обращенно-фазной тонкослойной хроматографии с применением сорбента С18.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

• Изучить хроматографическое поведение анализируемых веществ с целью поиска оптимальных условий определения при общем и частном скрининге
• Определить чувствительность различных детекторов при ненаправленном и направленном исследовании методом ОФ ТСХ
• Разработать методики пробоподготовки модельной смеси мочи на основе жидкость-жидкостной и твердо-фазной экстракции для последующего определения методом ОФ ТСХ
• Определить степень извлечения ряда исследуемых соединений в модельных смесях мочи денситометрическим методом
• Апробировать предложенные методики изолирования на реальных образцах мочи и внедрить результаты научного исследования в экспертную практику.

Личный вклад автора

Автором самостоятельно проведены исследования методом ОФ ТСХ по определению оптимальных условий идентификации ряда токсикологически важных соединений основного характера в условиях общего и частного скрининга с применением сорбента С18, осуществлен анализ полученных экспериментальных данных. Вклад автора является определяющим на всех этапах исследования от постановки задач, их экспериментальной реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и внедрения в практику.

Научная новизна

Проведено исследование по изучению хроматографического поведения наиболее важных с токсикологической точки зрения экзотоксикантов в условиях ОФ ТСХ с применением в качестве неподвижной фазы силикагеля с привитыми углеводородными радикалами С18. Разработаны условия для частного скрининга исследуемых групп веществ. Определена общая система растворителей при ненаправленном исследовании, а также метчик, состоящий из четырех представителей исследуемых соединений. Определена чувствительность различных детекторов при идентификации аналитов на пластине.

На основании проведенной сравнительной характеристики различных способов пробоподготовки модельной смеси мочи с последующей адаптацией к методу ОФ ТСХ разработана оптимальная по величине степени извлечения аналитов и минимальному количеству соэкстрактивных веществ методика ЖЖЭ в сочетании с вымораживанием. Преимущества данного способа изолирования были подтверждены на примере реальных образцов мочи пациентов.

Практическая значимость

Разработанные методики обнаружения ряда токсикологически важных лекарственных средств основного характера в условиях обращенно-фазной тонкослойной хроматографии с применением сорбента С18 расширяют возможности использования планарной хроматографии в химико-токсикологическом анализе. Применение в комплексе двух вариантов ТСХ, основанных на различных механизмах удерживания сорбатов, способствует повышению достоверности результатов при проведении экспертных исследований на предварительном этапе.

Предложенные методики обнаружения ряда токсикологически важных веществ в условиях ОФ ТСХ внедрены в практическую деятельность химико-токсикологической лаборатории ГБУЗ «Пермский краевой наркологический диспансер» (акт внедрения от 03 сентября 2012 г.), судебно-химических отделений ГКУЗОТ «Пермское краевое бюро судебно-медицинской экспертизы» (акт внедрения от 30 августа 2012 г.), ГБУЗ СО «Бюро судебно-медицинской экспертизы», г. Екатеринбург (акт внедрения от 17 сентября 2012 г.), КОГБСЭУЗ «Кировское областное бюро судебно-медицинской экспертизы» (акт внедрения от 02 октября 2012 г.), ФГБУЗ ЦМСЧ № 71 ФМБА России, г. Озерск Челябинской области (акт внедрения от 15 октября 2012 г.).

Разработанное в ходе выполнения диссертационной работы учебное пособие «Нормально-фазный и обращенно-фазный варианты тонкослойной хроматографии в химико-токсикологическом анализе» внедрено в учебный процесс ГБОУ ВПО ОрГМА Минздравсоцразвития России, г. Оренбург (акт внедрения от 20 сентября 2012 г.). Материалы диссертации прошли апробацию при проведении элективного курса «Хроматографические методы анализа», организованного на кафедре токсикологической химии ГБОУ ВПО ПГФА Минздравсоцразвития России для студентов 4 и 5 курсов (акт внедрения от 23 марта 2012 г.), а также цикла повышения квалификации специалистов в области клинической лабораторной диагностики (акт внедрения от 20 апреля 2012 г.).

По результатам исследований подготовлено, утверждено Ученым советом Российского центра судебно-медицинской экспертизы и разослано в территориальные бюро судебно-медицинской экспертизы информационное письмо «Применение обращенно-фазной тонкослойной хроматографии на предварительном этапе химико-токсикологических исследований».

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены в ходе Российской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы судебно-химических, химико-токсикологических исследований и фармацевтического анализа» (Пермь, 2009 г.); 75-й Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием, посвященной 75-летию КГМУ «Молодежная наука и современность» (Курск, 2010 г.); 74-й итоговой студенческой научно-практической конференции с международным участием, посвященной 100-летию со дня рождения профессора А.М. Дыхно (Красноярск, 2010 г.); межрегиональной научно-практической конференции с международным участием, посвященной 75-летию судебно-медицинской службы Кировской области «Актуальные вопросы судебно-медицинской науки и практики» (Киров, 2010 г.); итоговой научной конференции сотрудников КГМУ, Центрально-Черноземного научного центра РАМН и отделения РАЕН, посвященной 76-летию Курского государственного медицинского университета «Университетская наука: взгляд в будущее» (Курск, 2011 г.); научно-практической конференции с международным участием, посвященной 85-летию со дня рождения заслуженного деятеля науки РФ, профессора В.И. Алисиевича «Морфология критических и терминальных состояний» (Москва, 2011 г.); научно-практической конференции с международным участием, посвященной 75-летию Пермской государственной фармацевтической академии «Актуальные проблемы науки фармацевтических и медицинских вузов: от разработки до коммерциализации» (Пермь, 2011 г.); 77-й Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых «Молодежная наука и современность» (Курск, 2012 г.); научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы судебно-медицинской экспертизы» (Москва, 2012 г.).

Объем и структура работы

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (4 главы), общих выводов, списка литературы, включающего 103 наименования (из них 36 источников зарубежной литературы), приложения. Работа изложена на 149 страницах машинописного текста, включает 68 таблиц, 58 рисунков и 4 раздела приложения, включающего параметры удерживания исследуемых соединений в различных хроматографических условиях (к обзору литературы), характеристику исследуемых веществ, входящих в состав лекарственных форм, протоколы расчета содержания анализируемых соединений в моче денситометрическим методом, документы по внедрению результатов научных исследований.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 15 научных работ, из них 3 – в изданиях, рекомендованных ВАК, 1 учебное пособие.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований Пермской государственной фармацевтической академии (номер государственной регистрации 01.9.50 007417). Тема диссертации утверждена на заседании Ученого Совета Пермской государственной фармацевтической академии 27 ноября 2008 г., протокол № 3.

На защиту диссертации выносятся следующие положения:

• Оптимальные условия идентификации ряда представителей производных 1,4-бензодиазепина, фенотиазина, опиатов, опиоидов, местных анестетиков, антидепрессантов, антигистаминных средств, спазмолитических средств и средств, влияющих на центральную нервную систему посредством различных механизмов, методом ОФ ТСХ с применением сорбента С18 при общем и частном скрининге
• Пределы обнаружения анализируемых веществ различными детекторами при направленном и ненаправленном исследовании методом ОФ ТСХ
• Методики изолирования аналитов из модельной смеси мочи на основе жидкость-жидкостной и твердо-фазной экстракции с последующим определением экзотоксикантов методом ОФ ТСХ
• Результаты изучения эффективности различных способов пробоподготовки при проведении изолирования анализируемых веществ из мочи методом денситометрии, в том числе на реальных образцах.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Обзор литературы

На основании статистических данных экспертных организаций Пермского края за 2007-2011 гг. определен круг лекарственных средств основного характера, обнаруживаемых при проведении экспертиз. Представлены данные о большей распространенности нормально-фазного варианта ТСХ в сравнении с ОФ ТСХ. Описаны наиболее распространенные способы изолирования экзотоксикантов из мочи.

2. Объекты и материалы исследований

Объекты исследования в ходе проведения эксперимента:

• Растворы рабочих стандартных образцов исследуемых соединений (концентрация 1 мг/мл)
• Модельные смеси мочи (концентрация веществ 3 мкг/мл)
• Реальные образцы мочи пациентов.

Оборудование и средства измерений:

Пластины для ОФ ТСХ Merck DC–Alufolien RP–18F254, Германия; камеры стеклянные хроматографические; микрошприцы вместимостью 10, 50 мкл, фирма «Hamilton», Швейцария; нагревательное устройство УСП-1М (ТУ 4215-005-45843003-99), ЗАО «Сорбполимер», г. Краснодар, Россия; облучатель УФС-254/365 (ТУ 4215-004-16943778-99), ЗАО «Сорбполимер», г. Краснодар, Россия; денситометр Sorbfil (ТУ 4436-003-16943778-99), ЗАО «Сорбполимер», г. Краснодар, Россия; перемешивающее устройство ПЭ-6300, АО «Экрос», г. Санкт-Петербург, Россия; патроны для твердофазной экстракции Evolute ABN 25 мг/3 мл, 50 мг/3мл, компания Biotage, Швейцария.

3. Разработка методик обнаружения анализируемых веществ методом обращенно-фазной тонкослойной хроматографии

На процесс разделения в жидкостной хроматографии, в том числе при ее реализации на плоскости, оказывает влияние комплекс взаимодействий сорбента, сорбата, элюента. В ходе экспериментальной работы в качестве сорбента в условиях ОФ ТСХ нами был использован силикагель с привитым октадецильным фрагментом – С18. В качестве компонентов подвижной фазы использовали этанол 96 % (далее по тексту – «этанол»), метанол, ацетонитрил, воду очищенную (далее по тексту – «вода»). С целью увеличения селективности и эффективности подвижной фазы дополнительно были рассмотрены также аммиака раствор концентрированный (далее по тексту – 25 % раствор аммиака), диэтиламин, калия фосфата однозамещенного раствор 0,01 М. Детектирование вели УФ-облучением пластины при длине волны 254 нм.

Для каждой группы веществ, входящей в круг исследования, на основании коэффициентов разрешения нами были определены системы растворителей при частном и общем скрининге (таблица 1).

Таблица 1 – Системы хроматографического скрининга исследуемых групп веществ, разработанные в условиях ОФ ТСХ с применением сорбента С18