Разработка липосомальной лекарственной формы противоопухолевого препарата араноза

На правах рукописи

Козеев Сергей Геннадьевич

РАЗРАБОТКА ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ПРЕПАРАТА АРАНОЗА

14.04.01 - Технология получения лекарств

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата

фармацевтических наук

Москва – 2013

Работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова

Научные руководители:

доктор фармацевтических наук,

профессор Краснюк Иван Иванович

доктор фармацевтических наук,

профессор Оборотова Наталия Александровна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, Харитонов Юрий Яковлевич

профессор, заведующий кафедрой

физической, аналитической и

коллоидной химии

ГБОУ ВПО Первый МГМУ

им. И.М. Сеченова,

заслуженный деятель науки РФ

доктор фармацевтических наук, Гузев Константин Сергеевич

ведущий специалист отдела

обеспечения качества

ЗАО «Ретиноиды»

Ведущая организация:

Воронежский государственный университет

Защита диссертации состоится «20» марта 2013 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.040.09 при Первом МГМУ имени И.М. Сеченова по адресу: 119019, г. Москва, Никитский бульвар, д. 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Первого МГМУ имени И.М. Сеченова по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49.

Автореферат разослан «___» февраля 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 208.040.09,

доктор фармацевтических наук,

профессор Садчикова Наталья Петровна

Актуальность темы

Лекарственная терапия опухолей является актуальным разделом современной медицины. Однако большинство химиопрепаратов обладают рядом недостатков, к которым относится недостаточная избирательность действия и, вследствие этого, высокая общая токсичность, а также устойчивость опухолевых клеток к проводимой химиотерапии. На сегодняшний день описано много механизмов, приводящих к множественной лекарственной резистентности. Поэтому создание рациональных лекарственных форм, позволяющих наиболее полно реализовать возможности противоопухолевых препаратов, является актуальной задачей.

Существует ряд подходов к увеличению эффективности лекарственных препаратов, среди которых использование новых фармацевтических технологий для создания систем транспорта известных противоопухолевых лекарственных веществ (ЛВ). Одним из наиболее оптимальных вариантов для повышения их доставки к опухолевым клеткам является использование носителей, таких как липосомы. 

Опухолевые ткани отличаются от нормальных наличием деформированных капилляров с проницаемыми стенками и замедленным кровотоком. Благодаря данным эффектам, наноразмерные лекарственные формы, такие как липосомы, накапливаются в опухолевой ткани, тем самым повышая терапевтический эффект ЛВ, которое они переносят.

Липосомы представляют собой везикулы, состоящие из одной или нескольких фосфолипидных мембран, внутри которых находится водное пространство. В их водное пространство могут быть включены водорастворимые лекарственные вещества, а в липидный бислой – гидрофобные. Липосомы способны транспортировать ЛВ, снижать его общетоксическое действие, увеличивать терапевтический эффект. Основываясь на этих свойствах, липосомальные системы доставки противоопухолевых препаратов могут обуславливать фармакологическое преимущество перед нелипосомальными формами лекарств.

В настоящем исследовании при создании липосомальных лекарственных форм (ЛЛФ) в качестве модельного препарата использовали отечественное противоопухолевое ЛВ аранозу.

Арабинопиранозилметил нитрозомочевина (араноза) — отечественный противоопухолевый препарат, производное нитрозомочевины, синтезирована в конце 1970-х годов в лаборатории органического синтеза, лекарственная форма «Араноза лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,5 г» создана в лаборатории разработки лекарственных форм Онкологического научного центра АМН СССР. В результате клинических испытаний в конце 80-х годов установлена эффективность препарата при меланоме. Несмотря на преимущества перед аналогами (производными нитрозомочевины) – большая широта терапевтических доз и возможность применения в амбулаторных условиях, араноза обладает недостаточной селективностью действия.

В РФ в настоящее время ЛЛФ аранозы не производятся, импорт дорогостоящих зарубежных препаратов резко сужает возможность применения лекарственных препаратов в отечественной клинической практике. Разработка и производство ЛЛФ аранозы для лечения онкологических больных позволит увеличить эффективность проводимой химиотерапии.

Цель исследования

Получение липосомальной лекарственной формы противоопухолевого лекарственного вещества аранозы для увеличения селективности доставки в опухоль.

Задачи исследования

1. На основе технологических исследований выбрать состав ЛЛФ аранозы.
2. Разработать способ получения устойчивой при хранении лиофилизированной ЛЛФ аранозы для внутривенного введения.
3. Определить показатели качества для стандартизации ЛЛФ аранозы и разработать методики качественного и количественного анализа.
4. Сравнить цитотоксическую активность известной лекарственной формы «Араноза лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,5 г» и новой ЛЛФ «Араноза липосомальный лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 100 мг» в опытах in vitro и противоопухолевое действие в опытах in vivo.

Научная новизна результатов исследования

Впервые предложен состав и разработана технология получения отечественного противоопухолевого препарата – липосомальной аранозы в виде лиофилизата для приготовления раствора для инъекций. Изучено влияние различных криопротекторов на стабильность липосом с аранозой до и после лиофилизации. Разработан режим лиофилизации липосомальной аранозы.

Предложены методики качественного и количественного анализа ЛЛФ аранозы: определение компонентов лекарственной формы методом тонкослойной хроматографии и спектрофотометрическое определение содержания действующего вещества в лекарственной форме. Выбраны показатели качества лиофилизированной ЛЛФ аранозы. Показана стабильность лекарственной формы в процессе исследуемого срока хранения.

В экспериментах in vitro и in vivo по изучению цитотоксического и противоопухолевого действия показано, что липосомальный препарат обладает большей избирательностью действия по сравнению со свободной лиофилизированной формой аранозы.

Практическая значимость полученных результатов

Создана новая липосомальная лекарственная форма высокоактивного противоопухолевого ЛВ аранозы. В лаборатории разработки лекарственных форм НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН утвержден лабораторный регламент на производство ЛЛФ аранозы.

Разработан проект ФСП на препарат: «Араноза липосомальный лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 100 мг».

Представляется возможность проведения расширенных испытаний in vivo для изучения ЛЛФ аранозы на новых опухолевых моделях.

Положения, выносимые на защиту

1. Состав и технология получения ЛЛФ аранозы.
2. Выбор криопротектора и условий лиофилизации ЛЛФ аранозы.
3. Методики качественного и количественного анализа ЛЛФ аранозы.
4. Данные оценки эффективности действия липосомальной аранозы in vitro и in vivo.

Апробация работы

Материалы проведенных исследований представлены на конференциях: Итоговой всероссийской научной конференции молодых исследователей с международным участием «Татьянин день» (Москва, январь 2011 и 2012 гг.), Х Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 22-23 марта 2011г.), III Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноонкология» (Саратов, 6-7 сентября 2011г.), ХI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Нижний Новгород, 31 мая – 1 июня 2012г.), Межкафедральной научной конференции на кафедре фармацевтической технологии фармацевтического факультета ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова (Москва, 31 августа 2012 г.).

Личный вклад автора

Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, автором лично проведена аналитическая и статистическая обработка, научное обоснование и обобщение полученных результатов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и их внедрения в практику.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.01 – Технология получения лекарств. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 1, 3 и 4 паспорта специальности технология получения лекарств.

Связь задач исследования с проблемным планом

Диссертационная работа выполнена в соответствии с комплексной научной темой ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований» (номер государственной регистрации 01.2.006 06352). Тема включена в план научных исследований кафедры фармацевтической технологии «Разработка научных основ технологии, стандартизации и организации производства лекарственных средств».

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, полностью отражающих ее содержание, в том числе 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 147 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4-х глав собственных исследований и их обсуждений, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 25 таблицами и 19 рисунками. Библиографический список включает 166 наименований, в том числе 96 – на иностранном языке.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Получение дисперсии многослойных липосом аранозы

Для получения дисперсии многослойных липосом с инкапсулированной аранозой использовали метод Бэнгхема. Компоненты липидного бислоя: яичный фосфатидилхолин (ФХ), холестерин (Хол), фосфатидилэтаноламин-полиэтиленгликоль-2000 (ФЭ-ПЭГ-2000) растворяли в хлороформе. Полученный раствор фильтровали под вакуумом через фильтр с размером пор 0,22 мкм, количественно переносили в стерильную круглодонную колбу и выпаривали на роторном испарителе BCHI Rotavapor R-200 при температуре выше температуры фазового перехода липидов (+37°С) и давлении 24 мм рт. ст. до получения тонкой липидной плёнки на стенках колбы. Для полного удаления хлороформа проводили досушивание под вакуумом в течение 60 мин. Полученную липидную плёнку гидратировали предварительно профильтрованным (через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм) 2% раствором аранозы с добавлением сорбиновой кислоты при постоянном перемешивании. Предфильтрацию полученной дисперсии мультиламеллярных везикул проводили через фильтры с диаметром пор 0,4 мкм.

Получение дисперсии однослойных липосом аранозы

Измельчение небольших объёмов дисперсии (до 10 мл) проводилось на ручном мини экструдере Avanti Mini-Extruder последовательно через мембранные фильтры “Nuclepore” с диаметром пор 0,2 и 0,1 мкм. Однородные по размерам везикулы получали после 11 циклов экструзии.

В процессе масштабирования технологии измельчение проводили на экструдере LIPEX последовательно через мембранные фильтры с размером пор 0,2 и 0,1 мкм и давлении инертного газа 1,5 атмосфер. Однородные по размерам везикулы получали после 9 циклов экструзии.

Определение размера липосом

На всех стадиях технологического процесса размер везикул определяли с использованием метода корреляционной спектроскопии светорассеяния на наносайзере Nicomp 380 Submicron Particle Sizer.

Определение эффективности включения аранозы в липосомы

Для отделения липосом от не включившейся в везикулы аранозы применяли метод гель-фильтрации на колонке С-16 «GE Healthcare» с использованием гель-сорбента Sephadex G-50. Контроль разделения фракций осуществляли с помощью проточного спектрофотометра Uvis-920.

Количественное определение

Содержание аранозы определяли методом спектрофотометрии в

УФ-области на спектрофотометре Cary 100 Varian, Inс. при 240±2 нм.

Изучение цитотоксической активности

Для оценки роста опухолевых клеток и цитотоксической активности исследуемой ЛЛФ аранозы в опытах in vitro использован МТТ-тест. Опыт проводили на клеточных линиях опухолей человека: Mel Kor - метастатическая меланома и Jurkat – Т-клеточный лимфобластный лейкоз. Планшеты с клетками инкубировали в течение 72 часов. Измерения проводили на фотометрическом анализаторе иммуноферментных реакций «АИФР-01 Униплан».

Определение противоопухолевого действия

С целью сравнения противоопухолевого действия ЛЛФ аранозы с лиофилизатом свободной аранозы, провели исследование на мышах (самки гибриды первого поколения BDF1) с перевитыми опухолями лимфоцитарной лейкемии Р-388 и меланомы В-16 при различных путях введения.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выбор состава липосомальной дисперсии аранозы

Молярные соотношения липидных композиций липосом подбирали экспериментально с учётом воспроизводимости технологического процесса для получения стандартной и стабильной ЛЛФ аранозы.

В качестве основного компонента, формирующего липидный бислой, использовали фосфатидилхолин. Холестерин приводит к увеличению жесткости мембраны липосом, уменьшает текучесть липидного бислоя, а так же увеличивает его упругость и механическую прочность. Таким образом, присутствие Хол способствует повышению стабильности структуры везикул. Для предотвращения захвата липосом в кровяном русле клетками ретикуло-эндотелиальной системы добавляли фосфатидилэтаноламин, конъюгированный с гидрофильным полимером – полиэтиленгликолем, что приводит к увеличению циркуляции липосом в кровяном русле. Для стабилизации аранозы при хранении оптимальное значение рН среды создавали добавлением сорбиновой кислоты.

Молярные соотношения компонентов прописи подбирались экспериментально. Для выбора состава ЛЛФ аранозы в ходе исследований были наработаны модельные композиции, качество которых оценивали по ряду показателей, таких как размер липосом, стабильность, эффективность включения, фильтруемость через стерилизующие мембраны.

Влияние состава и метода изготовления на размер липосом и эффективность включения аранозы

В табл. 1 представлены результаты оценки качества моделей ЛЛФ аранозы по параметрам качества: размер везикул и эффективность включения аранозы. Многослойные липосомы всех модельных составов гомогенизировали путём экструзии через поликарбонатные фильтровальные мембраны.

Как видно из табл. 1, состав №1 имел низкий процент включения ЛВ. В составах №2 и №5 наблюдали одинаково высокий процент включения аранозы, но в последнем из перечисленных был более крупный размер везикул и дисперсия значительно хуже экструдировалась. Вероятно, это связано с увеличенным содержанием ФХ, что не оказало положительного влияния на эффективность включения ЛВ. Составы №3 и №4 имели более низкий процент включения аранозы, чем состав №2, что связано с увеличением в прописи количества аранозы.

Таблица 1

Изменение эффективности включения аранозы и размера липосом

в зависимости от состава

Состав №	Молярные соотношения ФХ:Хол:ФЭ-ПЭГ-2000:А	Размер липосом после экструзии, нм	Эффективность включения аранозы, %
1	1,0:0,36:0,025:0,30	163±4	58±2
2	1,0:0,24:0,017:0,81	167±2	81±2
3	1,0:0,24:0,017:0,99	195±5	71±3
4	1,0:0,18:0,013:0,74	197±4	71±3
5	1,0:0,18:0,013:0,60	183±3	79±2

Примечание: А – араноза.

Таким образом, наилучшим по оцениваемым параметрам оказался состав № 2, в котором обеспечена высокая эффективность включения (81±2%) и оптимальный размер везикул равный 167±2 нм (Рис. 1).

Рис. 1. Размер липосом аранозы (состав 2)

В исследованиях показано, что введение альфа-токоферола в состав липосомального бислоя привело к резкому снижению стабильности дисперсии и эффективности включения аранозы.

Сравнение эффективности измельчения липосомальной дисперсии методами измельчения ультразвуком, гомогенизации и экструзии на изучаемых моделях показало, что только экструзия позволяет получить гомогенные везикулы нужного размера и сохранить первоначальную эффективность включения аранозы (Табл. 2). Воздействие УЗ привело к незначительному уменьшению размера липосом и к резкому уменьшению эффективности включения ЛВ. Вместе с тем воздействие УЗ катализирует перекисное окисление ФХ, снижая качество липосомального препарата. При гомогенизации липосом на микрофлюидайзере также снижается эффективность включения аранозы.

Таблица 2

Влияние способа измельчения на показатели качества липосом аранозы

Способ измельчения	До измельчения		После измельчения
	Размер липосом, нм	Эффективность включения,%	Размер липосом, нм	Эффективность включения,%
Измельчение ультразвуком	360±5	81±2	250±12	55±3
Гомогенизация (микрофлюидизация)	360±5	81±2	130±11	50±3
Экструзия	360±5	81±2	166±5	80±2