Фармакогностическое изучение семян различных сортов амаранта печального (amaranthus hypochondriacus l.)

На правах рукописи

КОРЕНСКАЯ ИРИНА МИХАЙЛОВНА

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ СЕМЯН

РАЗЛИЧНЫХ СОРТОВ АМАРАНТА ПЕЧАЛЬНОГО

(AMARANTHUS HYPOCHONDRIACUS L.)

Специальность 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

Пермь – 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Воронежский государственный университет» Министерства образования и науки РФ

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор

Фурса Николай Сергеевич

ГБОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития РФ

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор

Белоногова Валентина Дмитриевна

ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздравсоцразвития РФ,

заведующий кафедрой фармакогнозии с курсом ботаники

доктор фармацевтических наук, доцент

Гейн Людмила Федоровна

ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития РФ,

заведующий кафедрой общей и биоорганической химии

Ведущая организация: ГБОУ ВПО « Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Минздравсоцразвития РФ

Защита состоится «26» февраля 2013 г. в 15 часов на заседании Диссертационного совета Д 208.068.01 при ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздравсоцразвития РФ по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Полевая, д. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО ПГФА Минздравсоцразвития России адресу: г. Пермь, ул. Крупской, д. 46.

Отзыв на автореферат просьба отправлять по адресу Диссертационного совета.

Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте Министерства образования и науки Российской Федерации http^// http://www.mon.gov.ru «___» декабря 2012 г. и на сайте ПГФА http://pfa.ru «___» декабря 2012 г.

Автореферат разослан «___» _____________ 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 208.068.01,

кандидат фармацевтических наук, доцент И.А. Липатникова

общая характеристика работы

Актуальность темы. Поиск растительных источников, содержащих различные биологически активные вещества и имеющих надежную сырьевую базу, является социально и экономически значимым направлением фармации.

Исследования видов рода Щирица (Амарант) свидетельствуют о том, что в них содержится уникальный сбалансированный комплекс БАВ (углеводы, белки, жирные кислоты, фосфолипиды, токоферолы). Отдельные представители рода достаточно изучены для нужд пищевой технологии (Е. Н. Офицеров, В. И. Костин, 1999; И. М. Магомедов, 2002.; Е. Г. Иоргачева, 2002;), в области селекции и интродукции (И. А. Чернов, 1992; П. Ф. Кононков, В. К. Гинс, М. С. Гинс, 2001; Т. И. Гопций, 2001; О. И. Криворученко, А.В. Железнов, Н. В. Бурмакина, 2009), биологии (Л. А. Мирошниченко, 2008). Вместе с тем они не являлись объектом углублённого фитохимического исследования для выявления возможностей их медицинского использования.

Семена различных сортов (Воронежский, Кизлярец, Кинельский, Крепыш, Янтарь) амаранта печального (A. hypochondriacus L.), интенсивно культивируемых в России, в том числе в Центральном федеральном округе, заслуживают внимания в качестве потенциального лекарственного растительного сырья, богатого природными БАВ, в частности, самым высококачественным растительным белком. Вместе с тем до настоящего времени в достаточной мере не изучено их качественное и количественное содержание, не исследован элементный состав, не определены физико-химические характеристики сырья и продуктов его переработки, в том числе жирного масла, реализуемого в качестве пищевой добавки. В связи с чем фармакогностическое изучение семян пяти сортов амаранта печального представляется весьма актуальным.

Цель и задачи исследования

Целью работы явился сравнительный анализ природных соединений 5 сортов амаранта печального с использованием современных методов, разработка нормативной документации на них и на мазь с амарантовым маслом.

Для достижения поставленной цели следовало решить следующие задачи:

• провести изучение веществ первичного (углеводы, аминокислоты, жирные кислоты, витамины) и вторичного обмена (терпены, стерины, фенольные соединения, органические кислоты) 5 сортов амаранта печального;
• сравнить элементный состав анализируемых образцов до и после экстракции жирного масла и оценить их экологическую чистоту;
• определить масличность и компонентный состав жирного масла семян различных сортов амаранта и установить показатели его качества;
• выявить характерные морфолого-анатомические признаки и провести определение товароведческих показателей семян пяти сортов;
• предпринять изучение ряда фармакологических свойств масла амаранта;
• разработать фармацевтическую модель мази с амарантовым маслом для наружного применения и оценить ее технологические и фармакологические свойства;
• составить проекты ФСП на семена и мазь с маслом амаранта.

Научная новизна. С использованием современных физико-химических методов исследования (хромато-масс-спектрометрия (ГХ/МС), масс-спектрометрия (МС) с индуктивно связанной плазмой, капиллярный электрофорез, УФ-спектрофотометрия, ВЭЖХ и др.) впервые проведено сравнительное фитохимическое изучение семян амаранта печального. При этом в ходе их стандартизации выявлены микродиагностические признаки и дано описание внешних признаков. Наряду с этим показана перспективность использования семян амаранта как важного природного комплекса различных БАВ (углеводов, белков, отличительным признаком которых является значительное количество лизина, жирного масла с высоким содержанием эссенциальных жирных линолевой и линоленовой кислот, сквалена, фосфолипидов (фосфатидилхолина), стеринов, токоферолов и органических кислот).

Методом МС впервые определен 61 элемент в семенах 5 сортов амаранта печального, которые имеют определенное значение в экологическом, токсикологическом, медицинском и хемотаксономическом аспектах.

С использованием метода ГХ/МС впервые проанализирован состав этанольного извлечения из семян и шрота амаранта печального, в результате которого идентифицировано 67 соединений, из которых 57 до и 60 после экстракции жирного масла гексаном с пищевым нефрасом.

Методом ВЭЖХ определено содержание жирных кислот, фосфолипидов и сквалена в жирных маслах, полученных из анализируемого сырья.

Для качественного и количественного определения токоферолов и фосфолипидов в жирном масле семян амаранта адаптирован метод ТСХ.

Проведено изучение раздражающего действия, острой и хронической токсичности, исследовано гипохолестеринемическое действие и бактерицидная активность жирного масла из семян амаранта печального.

Практическая значимость. Результаты проведенных исследований положены в основу проектов ФСП «Амаранта семена» и «Мазь с маслом амаранта». Данные по товароведческому анализу семян амаранта печального использованы при разработке ТУ 9719-003-77872064-2011 «Зерно амаранта», введенных 24.10.2011, ООО «Русская олива».

Методики качественного и количественного анализа отдельных групп БАВ семян различных сортов амаранта внедрены в учебный процесс кафедры фармацевтической химии и клинической фармации ГБОУ ВПО «Воронежская государственная медицинская академия им. Н.Н. Бурденко» (акт о внедрении от 19.03.12 г.), кафедры фармацевтической химии и фармацевтической технологии ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет» (акт о внедрении от 04.05.12 г.), кафедры фармакогнозии и фармацевтической технологии ГБОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия» (акт о внедрении от 23.01.12 г.).

Впервые на доклиническом этапе исследований обоснована целесообразность использования амарантового масла в качестве гипохолестеринемического и противоожогового средства, что позволяет в известной мере реализовать возможность применения семян амаранта печального в медицине.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Данные сравнительного изучения веществ первичного и вторичного обмена пяти сортов амаранта печального.
2. Итоги определения элементного состава и оценки экологической чистоты анализируемого сырья до и после экстракции жирного масла.
3. Результаты изучения компонентного состава экстракционного амарантового масла и обоснования возможностей его применения в медицине.
4. Характеристика морфолого-анатомических признаков семян амаранта печального и их товароведческих показателей.
5. Особенности фармакологического действия амарантового масла.
6. Результаты исследования фармацевтической модели мази с маслом амаранта.
7. Разработанные нормативные документы - проекты ФСП «Амаранта семена» и «Мазь с маслом амаранта».

Апробация и публикация результатов исследования

Основные результаты исследований доложены и обобщены на следующих межрегиональных и международных научно-методических конференциях: «Пути и формы совершенствования фармацевтического образования» (ВГУ, Воронеж 2003, 2005, 2007, 2010 гг.), «Проблемы здоровьесбережения школьников и студентов. Новые научные тенденции в медицине и фармации» (ВГУ, Воронеж 2008, 2011), «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (ПГФА, Пятигорск 2010, 2011, 2012), «Науково-технiчний прогрес i оптимiзацiя технологiчних процесiв створення лiкарських препаратiв» (ТДМУ, Тернопiль 2011); «Moderni vymozenosti vedy» (Praha, 2012); «Бъдещите изследвания» (София, 2012); «Europejska nauka XXI powieka – 2012» (Przemysl)» (2012), на научных конференциях студентов и молодых учёных ГБОУ ВПО ЯГМА (2010 – 2012), на ежегодных научных сессиях ФГБОУ ВПО ВГУ в период 2005–2012 гг.

Связь задач исследований с проблемным планом. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ФГБОУ ВПО ВГУ (код по ГРНТИ: 31.23). Тема диссертационной работы утверждена на заседании Ученого совета фармацевтического факультета ВГУ (протокол № 09 от 27.10.05 г.).

Личный вклад автора. Автор непосредственно участвовал в проведении научных экспериментов, обработке и интерпретации экспериментальных данных по изучению элементного, углеводного, аминокислотного, липидного и фенольного состава семян 5 сортов амаранта печального, в проведении сравнительной характеристики их микродиагностических признаков, в исследовании отдельных фармакологических свойств амарантового масла, в апробации результатов исследования, в составлении 2 проектов ФСП и подготовке публикаций по выполненной работе.

Публикации материалов исследования. По теме диссертации опубликованы 42 научные работы, из них 10 в журналах, в том числе 8 в изданиях, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 175 страницах текста компьютерной верстки и состоит из «Введения», «Обзора литературы» (1 глава), «Экспериментальной части» (5 глав), выводов, списка литературы, включающего 244 источника, в том числе 46 на иностранных языках, и приложений. Диссертация содержит 51 таблицу, 31 рисунок, в том числе 15 фотографий.

Во введении раскрыта актуальность темы, определены цель и задачи исследования, сформулирована научная новизна и практическая значимость работы. В первой главе обобщены данные литературы по ботанической характеристике и химическому составу видов рода щирица (Amaranthus) семейства амарантовые (Amaranthaceae), их применению в медицине, а также дана характеристика, классификация, физико-химические свойства и методы анализа жирных масел. Вторая глава посвящена материалам и методам исследования. Третья глава включает результаты определения элементного состава и исследования веществ первичного и вторичного обмена 5 сортов семян амаранта печального. В четвертой главе отражены результаты изучения амарантового масла и характеристика его качества. Пятая глава содержит данные по стандартизации семян амаранта печального. В шестой главе приведены результаты по исследованию раздражающего действия, определению острой и хронической токсичности, по изучению противомикробного и гипохолестеринемического действия амарантового масла. Приложения включают отдельные масс-спектры идентифицированных веществ, проекты фармакопейных статей, приведены результаты по исследованию фармацевтической модели мази с маслом амаранта, а также материалы, подтверждающие практическую значимость проведенных исследований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

объекты и методы исследования

Для сравнительного анализа нами использованы семена зерновых и овощных сортов (Воронежский, Кинельский, Крепыш, Кизлярец, Янтарь) амаранта печального (Amaranthus hypochondriacus L.), интродуцированных в Украине, в Российской Федерации (Центральный и Сибирский ФО) и интенсивно культивируемых в Воронежской, Белгородской и Липецкой областях.

Анализ БАВ проводили классическими и современными методами исследований, в частности бумажной (БХ) и тонкослойной хроматографией (ТСХ), методом капиллярного электрофореза (прибор Applied Biosystem 273 Т, США), хромато-масс-спектрометрией (ГХ/МС) (газовый хроматограф 6850 с масс-селективным детектором 5973 фирмы Agilent Technologies, США), ВЭЖХ с фотометрической детекцией (аминокислотные анализаторы: ААА-400, Чехия, и Hitachi 835, Япония), масс-спектрометрией с индуктивно связанной плазмой (масс-спектрометр ELAN-DRC-e, США), титриметрией, УФ-спектрофотометрией (СФ-56), товароведческого анализа, фармакологическими методами оценки острой и хронической токсичности, моделирования раздражающего, гипохолестеринемического, антибактериального действия, используя унифицированные биохимические методы исследования крови. При этом в работе использовали реактивы, стандарты, растворители, отвечающие требованиям соответствующей нормативной документации. Статистическую обработку данных проводили общепринятыми методами и с помощью программы «Statistica – 6,0».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Элементный состав

Определение макро-, микро- и ультрамикроэлементов в семенах пяти сортов амаранта печального и их шрота (после экстракции жирного масла гексаном с пищевым нефрасом) проводили методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной аргоновой плазмой на приборе ELAN-DRC-e (США). Для контроля точности определений применяли метод добавок.

В анализируемых образцах нами выявлен 61 элемент, среди которых 7 макро-, 54 микро- и ультрамикроэлемента (табл. 1), третья часть из которых является эссенциальными. Каждый образец характеризовался индивидуальными особенностями в накоплении отдельных элементов. Среди макроэлементов в семенах амаранта сорта Воронежский до и после экстракции преобладали калий и кальций, сорта Кизлярец, Кинельский и Янтарь – фосфор, калий, кальций, сорта Крепыш – фосфор, кальций и магний. Из микроэлементов во всех анализируемых образцах доминировало железо, затем в значительных количествах накапливались марганец, цинк, несколько меньше рубидий, титан, медь, стронций, барий и др.

Из приведённых в таблице 1 данных видно, что до экстракции жирного масла гексаном с пищевым нефрасом содержание половины элементов было большим, чем после неё, и наоборот. Содержание доминирующих элементов в семенах амаранта коррелировало с таковым в семенах льна (М.А. Гарумова, 2005), семенах гречихи (Л.И. Бутенко, 2010) и плодах расторопши пятнистой (А.В. Волоцуева, 2004.; В.М. Рыжов, 2009).

Накопление токсичных элементов (Pb, As, Cd, Hg) в семенах 5 сортов амаранта печального не превышало предел допустимых концентраций на период заготовки и исследования сырья (СанПиН 2.3.2.1078-01 от 2001 года). В связи с чем их следует считать экологически безопасными. Отмеченное послужило основанием к дальнейшему исследованию семян и получению из них жирного масла.

Из изложенного следует, что семена амаранта печального и, что важно, его шрота – источник многих эссенциальных элементов, недостаток которых в организме человека приводит к различным заболеваниям.

ВЕЩЕСТВА ПЕРВИЧНОГО И ВТОРИЧНОГО ОБМЕНА

Углеводы. Наличие углеводов в водных извлечениях из семян подтверждали обработкой трехкратным объемом 96% спирта этилового. Полученные рыхлые бело-серые осадки использовали для проведения реакции с реактивом Фелинга, подтвердившим присутствие в исследуемых образцах сахаров в связанном виде. Гравиметрическим методом определено содержание водорастворимых полисахаридов, пектинов, гемицеллюлозы А и В 5 сортов изучаемых семян. Отмечено наиболее высокое суммарное содержание углеводов в семенах амаранта печального сорта Воронежский (57 %), использованных для

Таблица 1 – Элементный состав семян пяти сортов амаранта печального до экстракции жирного масла (мкг/г)