Фитохимическое изучение экстрактов коровяка черного и возможности их использования в медицине

На правах рукописи

КАЛИНИНА СВЕТЛАНА АЛЕКСАНДРОВНА

ФИТОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЭКСТРАКТОВ КОРОВЯКА ЧЕРНОГО И ВОЗМОЖНОСТИ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В МЕДИЦИНЕ

14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

Пермь – 2013

Диссертационная работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

Петриченко Василий Михайлович

Сыропятов Борис Яковлевич

доктор фармацевтических наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

Фурса Николай Сергеевич

доктор фармацевтических наук,

профессор, заведующий кафедрой фармакогнозии и фармацевтической технологии ГБОУ ВПО «ЯГМА» Минздрава России

Эвич Нина Ивановна

кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры фармацевтической химии ФДПО и ФЗО ГБОУ ВПО «ПГФА» Минздрава России

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится «11» июня 2013 г. в 14.00 часов на заседании Диссертационного совета Д 208.068.01 при государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава России по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Полевая, 2. Тел./факс (342)233-5501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке при ГБОУ ВПО ПГФА Минздрава России по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Крупской, 46.

Автореферат разослан « » 2013 г.

Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте Министерства образования и науки РФ http://www.mon.gov.ru « » апреля 2013 г. и на сайте ГБОУ ВПО ПГФА Минздрава России http://pfa.ru « » апреля 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 208.068.01, кандидат фармацевтических наук

Н.В. Слепова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. В настоящее время лекарственные средства растительного происхождения составляют около 20% от общего числа препаратов. Растительные препараты используются в комплексном лечении хронических заболеваний, так как они обеспечивают безопасность терапии при длительном курсовом лечении.

С целью создания высокоэффективных и безопасных лекарственных средств актуальным является выделение из растительного сырья индивидуальных компонентов и создание новых фитопрепаратов.

Основным источником для поиска новых лекарственных растений является арсенал средств народной медицины. Широкое использование коровяка черного в народной медицине при лечении заболеваний сердечно-сосудистой, урогенитальной систем указывает на необходимость углубленного фитохимического анализа, исследования компонентного состава, определения групп соединений, проявляющих фармакологическую активность, и разработку препарата на его основе.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящей работы являлось комплексное исследование химико-фармакологических свойств, технологии и стандартизация экстрактов коровяка черного и обоснование возможности их использования в медицине.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить качественный состав биологически активных веществ в экстрактах из травы и различных органов к. черного.

2. Провести хроматографическое разделение экстракта к. черного и выделить основные фракции БАВ и индивидуальные соединения.

3. Разработать методики количественного определения флавоноидов и иридоидов для изучения количественное содержание БАВ в исследуемых экстрактах к. черного.

4. Провести химико-технологические исследования по разработке оптимальной технологии экстракта травы к. черного сухого.

5. Обосновать методы стандартизации, показатели и нормы качества экстракта к. черного сухого.

6. Разработать НД на экстракт к. черного сухой.

7. Выявить и оценить фармакологическую активность, острую токсичность фракций и экстрактов к. черного.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Впервые проведено комплексное фитохимическое исследование экстрактов из надземной части и различных органов к. черного.

Методом колоночной хроматографии из экстракта к. черного выделены фракции: полисахаридов, кумаринов, флавоноидов и фенолокислот; изучен их компонентный состав; впервые выделены и идентифицированы гесперидин, хлорогеновая и кофейная кислоты.

Разработана методика количественного определения флавоноидов в экстракте травы к. черного методом дифференциальной спектрофотометрии в пересчете на гесперидин.

Методом математического моделирования разработана оптимальная технология экстракта травы к. черного сухого. Обоснованы методы стандартизации, показатели и нормы качества экстракта, включенные в проект Фармакопейной статьи предприятия (ФСП).

Впервые выявлено гипотензивное, антикоагулянтное и диуретическое действие экстрактов к. черного. Установлена связь между фармакологической активностью и количественным содержанием группы БАВ.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. В результате проведенных исследований выделены индивидуальные соединения – гесперидин, хлорогеновая и кофейная кислоты. Разработан способ получения экстракта травы к. черного сухого, установлены основные показатели подлинности и доброкачественности экстракта, которые легли в основу нормативной документации. Доказана гипотензивная, антикоагулянтная, диуретическая активности экстракта к. черного. Подана заявка на патент № 2011126730 от 29.06.2011.

СТЕПЕНЬ ВНЕДРЕНИЯ. Теоретические положения и результаты экспериментальных исследований используются в учебном процессе и научно-исследовательской работе кафедры фармакогнозии с курсом ботаники Пермской государственной фармацевтической академии, кафедры фармакогнозии и ботаники фармацевтического факультета Новосибирского государственного медицинского университета, кафедры фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии Самарского государственного медицинского университета, кафедры фармакогнозии и фармацевтической технологии Ярославской государственной медицинской академии. Подготовлен к рассмотрению проект ФСП «Экстракт коровяка черного сухой».

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Результаты фитохимического анализа компонентного состава и количественного содержания основных групп БАВ в экстрактах к. черного.
2. Результаты хроматографического разделения экстракта к. черного и изучение компонентного состава фракций и выделение индивидуальных веществ.
3. Результаты фармакологических исследований экстрактов к. черного.
4. Обоснование методов стандартизации, показателей и норм качества экстракта надземной части к. черного сухого.

АПРОБАЦИЯ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ. Основные положения работы доложены и обобщены на научно-практических конференциях: VII Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2006); 65-ой открытой научно-практической конференции «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Волгоград, 2007); II международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения» (Санкт-Петербург, 2007); Актуальные проблемы фармацевтической науки и образования (ПГФА, Пермь, 2009 – 2012); ежегодной конференции «Фармация и общественное здоровье» (Екатеринбург, 2010); International conference «Renewable wood and plant resources: chemistry, technology, pharmacology, medicine» (Saint Petersburg, 2011); научной конференции «Curtin Health Innovation Research Institute (CHIRI) conference» (Австралия, Перт, 2012), научной конференции «The second International Conference and Exhibition, PharmaTech 2012 on Pharmaceutical, Nutraceutical and Cosmeceutical Technology» (Малайзия, Куала-Лумпур, 2012).

СВЯЗЬ ЗАДАЧ ИССЛЕДОВАНИЯ С ПРОБЛЕМАМИ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Пермской государственной фармацевтической академии (номер государственной регистрации 01.9.50 007426).

ЛИЧНОЕ УЧАСТИЕ АВТОРА. Автор непосредственно участвовал в проведении научных экспериментов, обработке и интерпретации экспериментальных данных, в апробации результатов исследования, подготовке публикаций по выполненной работе.

СООТВЕТСТВИЕ ДИССЕРТАЦИИ ПАСПОРТУ НАУЧНОЙ СПЕЦИАЛЬНОСТИ. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 2 и 3 паспорта фармацевтическая химия, фармакогнозия.

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам исследования опубликовано 20 научных работ, из них 5 в изданиях, рекомендованных ВАК.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертационная работа изложена на 204 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, четырех глав, отражающих результаты собственных исследований и выводов. Работа иллюстрирована 60 таблицами и 29 рисунками. Библиографический указатель включает 295 источников, из них 193 на иностранных языках.

Во введении изложена актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, обозначена новизна и практическая значимость проведенных исследований; описаны положения, выносимые на защиту.

Первая глава содержит аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы: систематическое положение, распространение рода Verbascum L. и вида V. nigrum L. в Российской Федерации и за рубежом, ботаническое описание; химический состав и биологические свойства основных компонентов V. nigrum, данные о применении вида в народной медицине и экспериментальной фармакологии, обоснование перспективности изучения V. nigrum и разработки на его основе фитопрепаратов направленного действия.

Вторая глава посвящена описанию объектов и методов исследования.

В третьей главе отражены результаты исследований качественного состава и количественного содержания БАВ экстракта к. черного. Определение состава фенольных и иридоидных соединений, идентификация хлорогеновой и кофейной кислот, гесперидина, кверцетина, лютеолина и аукубина. Методом колоночной хроматографии разделены фракции основных групп БАВ, выделены индивидуальные компоненты, при помощи УФ, ИК и ПМР спектроскопии доказана их структура. Приведена модификация методики количественного определения иридоидов фотоэлектроколориметрическим методом для экстракта. Определено количественное содержание фенольных соединений в экстрактах коровяка черного.

В четвертой главе изложена разработка технологии экстракта травы к. черного.

Пятая глава посвящена исследованию фармакологической активности экстрактов и БАВ к. черного.

В шестой главе приведена разработка нормативной документации на экстракт к. черного сухой.

В приложении представлены лабораторный регламент на технологию экстракта к. черного сухого, проект ФСП «Экстракт коровяка черного сухой», исследования микробиологической чистоты экстракта, результаты апробации методики количественного определения флавоноидов в пересчете на гесперидин, основные документы, отражающие внедрение результатов диссертационной работы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования

Объектами исследования служили экстракты водные и спиртовые сухие травы, стеблей, листьев, цветков, корней трех видов рода Verbascum – Коровяк (V. nigrim – к. черный, V. thapsus – к. обыкновенный, V. densiflorum – к. скипетровидный) и ряд фракций БАВ к. черного. Образцы растений рода Verbascum для получения экстрактов заготовлены на территории Пермского края, Удмуртской республики и Свердловской области и на интродукционном участке питомника ПГФА в период 2006–2011 гг.

Исследуемые экстракты и извлечения получены по четырем методикам:

Методика I: 50 г измельченного и просеянного сквозь сито 2 мм растительного материала (трава, листья, стебли, цветки, корни) помещали в круглодонную колбу, заливали 300 мл воды и нагревали на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 2 ч (экстракцию повторяли 2 раза); извлечения охлаждали, процеживали и объединяли; сгущали на ротационном испарителе марки ИР-1 под вакуумом. Извлечение выдерживали в сушильном шкафу при температуре не более 60С в течение 6 ч, до полного удаления влаги.

Методика II: 50 г измельченного и просеянного сквозь сито 2 мм растительного материала (трава, листья, стебли, цветки, корни) помещали в круглодонную колбу, заливали 300 мл этанола 70% и нагревали на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 2 ч; извлечение охлаждали, фильтровали через бумажный фильтр; сырье повторно заливали 300 мл этанола 40% и нагревали на кипящей водяной бане с обратным холодильником 2 ч; извлечения объединяли; сгущали на ротационном испарителе под вакуумом. Извлечение выдерживали в сушильном шкафу при температуре не более 60 С в течение 3 ч, до полного удаления экстрагента.

Методика III: измельченную и просеянную сквозь сито 1 мм траву к. черного экстрагировали методом реперколяции с законченным циклом в батарее из трех перколяторов, имеющих различную емкость. В качестве экстрагента использовали этанол 60%. Сырье (100 объемных частей) в экстракторы загружали в убывающих количествах в соотношении 50:30:20. Концентрированную вытяжку сливали в объемных частях в возрастающем соотношении 20:30:50, в целом, получали 100 объемных частей концентрированной вытяжки; процеживали, сгущали на ротационном испарителе под вакуумом. Густой экстракт выдерживали в сушильном шкафу при температуре не более 60 С в течение 3 ч, до полного удаления экстрагента.

Методика IV: 400 г измельченной надземной части до размера частиц менее 5 мм помещали в круглодонную колбу и подвергали исчерпывающей экстракции: Сырье заливали 1,5 л этанола 70%, нагревали на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 5 ч; извлечение охлаждали, процеживали; затем заливали 800 мл этанола 40% нагревали на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 5 ч; извлечение охлаждали, процеживали; заливали 800 мл воды, нагревали на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 5 ч; извлечение охлаждали, процеживали. Полученные извлечения объединяли, сгущали на ротационном испарителе под вакуумом до объема 150 мл.

Качественный состав и количественное содержание БАВ исследовали с помощью современных методов фитохимического анализа: хроматография на бумаге и в тонком слое сорбента, фотоэлектроколориметрия, УФ спектроскопия. Спектрофотометрическое исследование проводилось на приборе СФ-2000.

Разделение суммы основных групп веществ с целью получения фракций биологически активных соединений проводили методом колоночной хроматографии, в качестве сорбентов использовали полиамид (фракция 50-160 m, Германия «Fluka») и алюминия оксид (для хроматографии). Доказательство структуры выделенных соединений проводили с использованием физико-химических методов анализа: определение температуры плавления на приборе Gallenkamp, определение растворимости согласно методике ГФ XII, ИК спектры, выполнены на спектрометре UR-20 Spectrod в таблетках калия бромида (концентрация вещества 0,5%). 1H ЯМР спектры, выполнены на спектрометре Bruker Avance III (400 МГц), в качестве растворителя был использован ДМСО – d6, в качестве внутреннего стандарта применяли тетраметилсилан (TMS).

Гипотензивную активность исследовали на наркотизированных мединалом кошках (400 мг/кг). Для исследования одного экстракта использовали шесть животных. Все исходные экстракты и фракции БАВ вводили внутривенно в дозе 50 мг/кг, предварительно растворив в 5 мл изотонического раствора.

Антикоагуляционную активность определяли in vitro при помощи коагулометра «Minilab-701». Для опытов использовали цитратную кровь. Экстракты и фракции БАВ испытывали в концентрации 1 мг/мл крови. В качестве контроля использовали цитратную кровь с натрия хлоридом. Эталоном сравнения служил гепарин в концентрации 1 ЕД/мл крови. Для определения механизма антикоагулянтной активности методом центрифугирования получали плазму, обогащенную тромбоцитами, и безтромбоцитную.

Диуретическую активность изучали на крысах-самцах массой 250-300 г. Исследуемые экстракты вводили в дозе 50 мг/кг. Препараты сравнения готовили из травы хвоща полевого и листьев брусники. Экскрецию креатинина с мочой определяли унифицированным методом Поппера, основанном на реакции Яффе, с помощью стандартного набора реактивов. Концентрацию ионов натрия и калия в моче определяли методом фотометрии на пламенном фотометре JENWAYPSP7.

Изучение острой токсичности сухих экстрактов и фракций к. черного проводили на белых мышах при однократном пероральном введении.

Экспериментальные животные находились в стандартных условиях вивария на типовом рационе в соответствии с нормами, утвержденными Приказом Минздрава СССР № 1179 от 10.10.1983 г., свободном доступе к пище и воде при 12-14-часовом световом дне. Все манипуляции с экспериментальными животными выполнялись в соответствии с правилами гуманного отношения к животным, методическими рекомендациями по их выведению из опыта и эвтаназии, регламентированными «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ МЗ СССР № 775 от 12.08.1977 г.).

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью программ статистической обработки данных «STAT – Статистика». Для выявления статистической значимости различий использовали параметрический критерий Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучение качественного и количественного состава БАВ

В результате фитохимического анализа в экстрактах к. черного установлено наличие основных групп биологически активных веществ: флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, иридоидов, кумаринов, полисахаридов и сапонинов; методами хроматографии на бумаге и в тонком слое сорбента по значению Rf, окраске реактивами и методом добавки идентифицированы: кверцетин, лютеолин, гесперидин, кофейная и хлорогеновая кислоты, аукубин и изокаталпол. В экстрактах к. черного доказано отсутствие сильнодействующих веществ, таких как алкалоиды и сердечные гликозиды.

Для изучения количественного содержания иридоидов и флавоноидов в экстрактах к. черного разработана методика количественного определения флавоноидов и модифицирована методика количественного определения иридоидов (табл. 1).

Таблица 1

Метрологические характеристики методик количественного определения иридоидов и флавоноидов в экстракте травы V. nigrum