авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ РОССИЙСКАЯ БИБЛИОТЕКА - WWW.DISLIB.RU

АВТОРЕФЕРАТЫ, ДИССЕРТАЦИИ, МОНОГРАФИИ, НАУЧНЫЕ СТАТЬИ, КНИГИ

 
<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:   || 2 | 3 |

Разработка методов анализа флавонов как индикаторных компонентов лекарственного растительного сырья

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

КОШЕЧКИНА АННА СЕРГЕЕВНА

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ АНАЛИЗА ФЛАВОНОВ КАК ИНДИКАТОРНЫХ КОМПОНЕНТОВ ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ

15.00.02 фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертация на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

Москва - 2007

Работа выполнена в ГОУ ВПО Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова и ГУ НИИ питания РАМН

Научные руководители:

академик РАМН,

доктор фармацевтических наук,

профессор Арзамасцев Александр Павлович

доктор химических наук Эллер Константин Исаакович

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук,

профессор ГОУ ВПО

ММА им. И.М. Сеченова Ермакова Валентина Алексеевна

доктор фармацевтических наук,

Ведущий научный сотрудник ФГУ

«Научный центр экспертизы средств

медицинского применения» Титова Анна Васильевна

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений РАСХН

Защита диссертации состоится « » 2007 г. в часов на

заседании диссертационного совета Д.208.040.09 при ГОУ ВПО Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова (119019 г. Москва, Никитский б-р, 13).

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова (117998, г. Москва, Нахимовский пр-т, 49).

Автореферат разослан « » 2007 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор фармацевтических наук,

профессор Садчикова Наталья Петровна

общая характеристика работы

Актуальность темы. Флавоноидами называется группа природных полифенольных биологически активных соединений – производных бенз--пирона, в основе которых лежит фенилпропановый скелет, состоящий из С6-С3-С6 углеродных единиц. К основным классам флавоноидов относятся флавоны, флаваноны, дигидрохалконы, халконы, антоцианидины, флаванонолы (дигидрофлавонолы), флавонолы, и изофлавоноиды. Разнообразие флавоноидов обуславливается наличием большого числа гидроксилированных, метилированных, ацилированых, О- и С-гликозилированных производных в ароматических ядрах А и В, а также асимметрических атомов углерода в пирановом гетероцикле. К классу флавонов (выделено около 20 агликонов) относятся окисленные флавоноиды, не имеющие гидроксила в 3-м положении (кольцо В).

Интерес к природным флавонам связан с их выраженными антиоксидантными свойствами, для ряда флавонов показаны их антиаллергенные, противоспалительные, антивирусные, антибактериальные свойства и другие типы биологической активности. Наиболее ценными источниками флавонов являются прополис, трава петрушки кудрявой и корни шлемника, содержание флавонов в этих объектах превышает 1-1,5%.

На основе прополиса разработан целый ряд препаратов, среди которых широко известны «Прополиса настойка», мазь «Пропоцеум», аэрозоль «Пропосол» и др. Шлемник байкальский используется как сырье для приготавления настойки гипотензивного и седативного действия. Петрушка кудрявая является традиционным пищевым растением. Также прополис, шлемник байкальский и петрушка кудрявая входят в состав зарегистрированных биологически активных добавок (БАД) к пище.



В настоящее время становится все более актуальной проблема безопасности и подлинности сборов лекарственных трав и биологически активных добавок, а также разработки достоверных критериев их идентификации.

Необходимость определения незначительных концентраций действующих веществ на фоне сложного матрикса БАД предъявляет высокие требования к селективности и чувствительности методов анализа.

Решение этих задач тормозится отсутствием в большинстве случаев достоверных методов контроля действующих начал в составе комплексных БАД. Большинство существующих нехроматографических методов определения индикаторных компонентов раститель­ных БАД неселективны, трудоёмки и могут в отдельных случаях приводить к получению, как ложноположительных результатов, так и к искажению количест­венных данных.

Одни­ми из наиболее перспективных методов для решения этих задач являются хроматографические методы, сочетающие высокую эффективность разделения компо­нентов БАД с избирательностью и чувствительностью детектирования.

Цель и задачи исследования

Цель настоящего исследования - разработать методики анализа флавонов в наиболее ценных источниках этих веществ: прополисе, корнях шлемника и траве петрушки. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи.

  1. Изучить физико-химических свойства флавонов;
  2. Разработать методики пробоподготовки сырья и продуктов на его основе, обеспечивающие наибольшую эффективность экстракции, характеризующиеся невысокой трудоемкостью;
  3. Подобрать оптимальные хроматографические условия для определения флавонов на фоне сложного матрикса;
  4. Оценить параметры пригодности хроматографических систем;
  5. Разработать методики количественного определения флавонов;
  6. Оценить метрологические характеристики разработанных методик;
  7. Апробировать разработанные методики на образцах растительного сырья, экстрактов растительного сырья, лекарственных препаратов, БАД и обогащенных продуктов на его основе.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук Диссертационная работа выполнена в рамках НИР кафедры фармацевтической химии ММА им. И.М. Сеченова «Совершенствование контроля качества лекарственных средств», № госрегистрации 01.200.110545.

Научная новизна результатов исследования. Разработаны оригинальные методики идентификации и количественного определения индикаторных флавонов в лекарственных препаратах, БАДах и пищевых продуктах: определение апигенина, акацетина и хризина в прополисе, определение байкалина в шлемнике байкальском, определение апиина и малонилапиина в петрушке кудрявой.

Практическая значимость результатов исследования. Разработанные методики использовались при гигиенической экспертизе более 80 БАД и сырья для БАД к пище в ГУ НИИ Питания РАМН. Методики определения апигенина, акацетина и хризина в прополисе, определение байкалина в шлемнике байкальском, определение апиина и малонилапиина в петрушке кудрявой включены в «Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище» (дополнение к Р4.1.1672-03, Минздрав РФ).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на межрегиональной научно-практической конференции «Питание здорового и больного человека» (май 2007г., г. Рязань); на научных конференциях кафедры фармацевтической химии с курсом токсикологической химии ММА им. И.М.Сеченова (2005 - 2007гг.); на Международной научно-практической конференции Apimondia (июль 2005, г. Дублин); на семинаре «Аналитическая химия в контроле безопасности, качества и подлинности пищевых продуктов и биологически активных добавок к пище» AnalyticaExpo-2006 (апрель 2006г., Москва), конгрессе «Фитофарм 2006» (июнь 2006 г., Санкт-Петербург)

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 103 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов исследования и их обсуждения, выводов и библиографи­ческого указателя, включающего 102 источников. Работа иллюстрирована 16 рисун­ками и 21 таблицами.

Положения, выносимые на защиту:

  • Метод количественного ВЭЖХ­определения индикаторных производных флавоноидов прополиса: кемпферола, изорамнетина, апигенина, хризина, акацетина, кемпферида, галангина и пиноцембрина;
  • Метод количественного ВЭЖХ­определения флавона байкалина в корнях шлемника байкальского Scutellaria baicalensis;
  • Метод количественного ВЭЖХ­определения флавона апиина в траве петрушки кудрявой Petroselinum crispum;
  • Результаты сравнительной оценки качества и полинности различных лекарственных фитопрепаратов, БАД и пишевых продуктов на основе прополиса, петрушки кудрявой и шлемника байкальского.

Основное содержание работы

Материалы и методы исследования

В ходе эксперимента были исследованы различные виды растительного сырья (24 вида), экстрактов на основе растительного сырья (11), лекарственных препаратов (3), БАД (47), а также был проанализирован ряд обогащенных продуктов (5).

Методы исследования. Для количественного определения флавонов в различных объектах использовался метод ВЭЖХ на хрома­тографе «Agilent 1100 series» (США) с УФ-спектрофотометрическим детектором на диодной матрице (СДДМ), флуориметрическим детектором (ФЛД). Идентификация неизвестных соединений проводилась на хроматографе с масс-спектрометрическим детектором «Agilent» 1100 series LC/MSD Trap SL family (США), в качестве неподвижной фазы использовались хроматографические колонки разных производителей: Phenomenex Luna 5 C18(2) 250 х 4,6 мм, США, Wakosil 5 C18(2) 250 х 4,6 мм. Концентрация определялась методом внешнего стандарта.

Статистическую обработку результатов исследования проводили по ФС: «Статистическая обработка результа­тов химического эксперимента и биологических испытаний» (ГФ XI).

Результаты исследований

Анализ производных флавона в лекарственном сырье и фитопрепаратах на основе прополиса. Для подбора оптимального растворителя была приведена сравнительная характеристика смесей спирта с водой в различных концентрациях для экстракции. Оптимальной для экстракции оказалась смесь воды с этанолом с концентрацией 80%.

Прополис представляет собой сложный комплекс веществ разнообразной природы, поэтому прежде чем провести анализ полифенольных соединений необходимо предварительно избавится от сопутствующих веществ, загрязняющих колонку и дающих опалесценцию при добавлении реактивов.

Очистка производится с помощью колоночной хроматографии на гидрофобном матриксе – XAD. Контроль за полнотой извлечения осуществлялся методом обращеннофазовой ВЭЖХ.

На гидрофобный матрикс помещали 2мл 10% экстракта прополиса и промывали 15 мл воды. Агликоны флавоноидов не смываются с XAD водой, таким образом происходит очистка прополиса от водорастворимых веществ (органических кислот и углеводов).

Оптимальными условиями очистки прополиса на ХАД является элюирование 2мл 10% экстракта 100мл 80% спирт, при необходимости элюент упаривают. Данный метод позволяет выделить флавоноидную фракцию без примеси длинноцепочечных спиртов, дающих дополнительные пики на хроматограмме (55-80 мин), которые существенно увеличивают время анализа и загрязняют колонку, а при спектрофотометрическом определении дают опалесценцию при добавлении реактивов.

На рисунке 1представлена хроматограмма прополиса до очистки; на рисунке 2 – хроматограмма флавоноидной фракции прополиса после очмстки.

 Хроматограмма экстракта прополиса-0

Рис. 1. Хроматограмма экстракта прополиса до очистки

 роматограмма экстракта прополиса-1 Рис.2 Хроматограмма экстракта прополиса после очистки на ХАД

Применение химической модификации для подтверждения флавоноидного состава прополиса

На долю митилированных флавоноидов прополиса приходится более 50% от общей суммы флавоноидов. Для идентификации данных соединений необходимы дорогостоющие, труднодоступные стандарты. Применение химической модификации позволило снизить общую стоимость методики и получить экзотические стандарты в условиях лаборатории.

Акацетин, кемпферид, диметилкемпферолл и пиностромбин были получены в ходе метилирования деазометаном стандартных образцов апигенина кемпферола и пиноцембрина. Для проведения реакции приготавливали ацетонитрильные растворы стандартов с концентрацией 0,02 мг/мл. К 1 мл раствора стандарта прибавляли 2 мл раствора диазометана в эфире и 200мкл метанола в качестве катализатора. Реакционную смесь выдерживали 20 минут с темном месте без доступа воздуха. Затем проводили хроматографическое исследование.





Время удерживания пиков соединений, полученных в ходе реакции с деазометаном, увеличивалось относительно пиков исходных стандартов, в следствии того, что метилпроизводные менее полярны. Структура полученных соединений подтверждалась данными ВЭЖХ-МС: молекулярные массы всех продуктов реакции отличались от исходного стандарта либо на 15, либо на 30 реже 45, что соответствует моно-, ди и триметилпроизводным (Mw(CH3+)=15).

Выбор оптимальных условий для разделения флавоноидов прополиса

Для проведения анализа использовалась обращенно - фазовая ВЭЖХ.

УФ – детекторование. Учитывая, что флавоноиды, входящие в состав прополиса имеют разные максимумы поглощения, их содержание измеряют при разных длинах волн Длина волны детектирования 290нм (для пиноцембрина) и 365нм (для остальных флавоноидов).

Колонка: Luna C18, 5 мкм 250мм х 4.6 мм фирмы «Phenomenex»

Скорость потока подвижной фазы 1,0 мл/мин

Подвижная фаза: Метанол : трихлоруксусная кислота (рН 2.6) (3:2)

Флавоны, как полифенольные соединения обладают слабокислотными свойствами и способны к диссоциации. В нейтральной среде вследствие экстракции, могут одновременно присутствовать диссоциированные и недиссоциированные формы флавонов, что может снижать эффективность разделения. Поэтому добавление в систему кислоты, необходимо для подавления собственной диссоциации флавонов. Кроме того, кислота выравнивает дефекты сорбента, в котором могут находиться катионы, и подавляет связывание разделяемых соединений кислотной природы компонентами сорбента. Установлено, что оптимальное значение рН подвижной фазы находится в пределах 2,5­2,8.

Пример хроматограммы российского прополиса при длине волны 365 нм представлен на русунке 3.

РРис. 3. Хроматограмма российского прополиса при 365нм. Времена удерживания флавоноидов: апигенин 7,7; кемпферол 8,5; изорамнетин 9,1; хризин 24,4; акацетин 25,8; кемпферид 30,2; галангин 31,6; диметилкемпферол 37, 6

Хроматографические характеристики и параметры пригодности хроматографической системы разработанной методики приведены в таблице 1.

Таб. 1 Параметры пригодности хроматографической системы для флавоноидов прополиса

флавоноиды tR, мин. K N R
Апигенин 7,7 2,85 4100 1,14 1,09 3,15 1,06 1,18 1,05 1,20 1,4 1,1 19,6 1,6 4,5 1,2 4,3
Кемпферол 8,5 3,25 4800
Изорамнетин 9,1 3,55 3500
Хризин 24,4 11,20 22000
Акацетин 25,8 11,90 19900
Кемпферид 30,2 14,10 15500
Галангин 31,6 14,80 17000
Диметилкемпферол 37,6 17,80 20700

Как следует из таблицы эффективность колонки составила более 4100 т.т. селективность колонки для всех соединений была более 1,0, а разрешение составило от 1,1 до 19,6

Статистическая обработка результатов. Для оценки точности и воспроизводимости методики были рассчитаны метрологические характеристики по результатам 5 параллельных измерений. Для флавоноидов проводились измерения раствора с концентрацией 0.05 мг/мл. В таблице 7 указаны результаты анализа, в таблице 2 рассмотрены метрологические характеристики метода анализа

Таб.2 Метрологические характеристики метода анализа флавоноидов прополиса

Флавоноиды х s2 s P t(Р, f) x ,%
Кемпферол 4.9 0.06 0,24 95% 2,78 0.3 6
Изорамнетин 4.8 0.06 0,24 95% 2,78 0.3 6
Апигенин 5.2 0.065 0.25 95% 2,78 0.31 6.2
Хризин 5.1 0.0075 0.087 95% 2,78 0.12 2.4
Акацетин 5.1 0.02 0.14 95% 2,78 0.17 3.4
Кемпферид 4.9 0.0675 0.26 95% 2,78 0.32 6.4
Галангин 4.8 0.06 0,24 95% 2,78 0.3 6
Диметилкемпферол 5.1 0.075 0.25 95% 2,78 0.31 6.2


Pages:   || 2 | 3 |
 

Похожие работы:










 
© 2013 www.dislib.ru - «Авторефераты диссертаций - бесплатно»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.