авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ РОССИЙСКАЯ БИБЛИОТЕКА - WWW.DISLIB.RU

АВТОРЕФЕРАТЫ, ДИССЕРТАЦИИ, МОНОГРАФИИ, НАУЧНЫЕ СТАТЬИ, КНИГИ

 
<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |

Фармакогностическое изучение лекарственных растений с использованием молекулярно- -биологических методов

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Баева Вера Михайловна

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ

ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ С

ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОЛЕКУЛЯРНО-

-БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ

15.00.02- фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук

Москва - 2009

Диссертационная работа выполнена в ГОУ ВПО Московская медицинская академия

имени И.М. Сеченова Росздрава и в НИИ физизико-химической биологии им. А.Н. Бело-зерского МГУ им. М.В.Ломоносова

Научные консультанты:

член-корр. РАМН, доктор фармацевтических наук

профессор Ирина Александровна Самылина

академик РАЕН, доктор биологических наук

профессор Андрей Сергеевич Антонов

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук,

профессор Сокольская Татьяна Александровна

доктор фармацевтических наук Баландина Ирина Анатольевна

доктор фармацевтических наук,

профессор Патудин Александр Васильевич

Ведущая организация: ГОУ ВПО Ярославская Государственная

медицинская академия

Защита состоится « «___________2009 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д.208.040.09. при Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова

(г. Москва, Никитский бульвар, 13).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова (117998, г. Москва, Нахимовский пр., д. 49).

Автореферат разослан « » 2009г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д.208.040.09.

доктор фармацевтических наук, Наталья Петровна Садчикова

профессор

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Перспективность исследований лекарственных растений народной медицины несомненна для современной отечественной фар-мации. При введении таких растений в медицинскую практику в первую оче-редь следует проводить целый комплекс исследований, устанавливающих их видовую принадлежность и очерченностъ границ вида.

Во многих родах, в том числе и лекарственных растений с богатым видовым составом,отмечено такое широко распространенное явление, как полиморфизм, который затрудняет видовую идентификацию растений при осуществлении за-готовки лекарственного растительного сырья и создает необходимость опреде-ления глубины этой изменчивости на уровне генома растения.

Многие лекарственные растения обладают аберратными формами размноже-ния (например, апомиксисом) или склонны к образованию межвидовых гибри-дов. Эти проблемы характерны для большого числа лекарственных растений семейств: розоцветные, бобовые, гречишные, кипрейные, сложноцветные и др. Некоторые виды из этих семейств применяются в научной медицине, а такие как представители рода манжетка, язвенник, ястребинка, кипрей и многие дру-гие являются перспективными для отечественной научной медицины. Разработка оптимальных методик изучения лекарственных растений будет спо-собствовать сохранению ценных сырьевых ресурсов (В.В.Алёхин, 1938).



В связи с этим вопросы совершенствования определения равноценности ви-дов при изучении лекарственных растений с использованием новейших дости-жений науки обоснованы и своевременны. Актуально введение в практику оте-чественного здравоохранения новых видов лекарственного растительного сы-рья и расширение ассортимента препаратов обладающих противовоспалитель-ным, противоопухолевым лимфотропным и др., действием.

Также актуальным является расширение арсенала методов определения под-линности. Это может быть сделано в настоящее время, в частности с привлече-нием наиболее современных и перспективных молекулярно-биологических ме-тодов.

Известно, что манжетки способны образовывать агамный комплекс (V.Grant, 1981), который находится на стадии поздней зрелости и его агамоспермная су-перструктура достигает полного развития.Такие популяции являются непрерыв ным источником возникновения агамоспермных микровидов.

В роде манжетка выделено четыре группы, одна из которых – Vulgares не яв-ляется монотипной и её границы до сих пор не ясны (S. Frhner, 1986),так как описано несколько амфимиктических видов и множество апомиктических ага-мных видов. Манжетки этой группы предложено трактовать, как агамный ком-плекс (V.Grant, 1981). Для некоторых из них в пределах Европейской части России установлен факультативный апомиксис (К.П.Глазунова, 1977,1987). У манжетки обыкновенной высокая изменчивость проявляется в наличии много-численных форм,групп особей или отдельных экземпляров,среди которых мно-гие агамные виды описаны по морфологическим признакам: опушение, разме-ры и геометрическая форма вегетативных, генеративных органов или их частей. Кроме того, отмечено наличие многочисленных переходных форм и значитель-ные колебания хромосомных чисел от 64 до 146. Только на территории Евро-пейской части нашей страны описано более 56 видов манжетки. Некоторые ис-следователи относят к манжетке обыкновенной пять-шесть агамных видов, та-ких как м. балтийская, м. изящная, м.остролопастная, м. близкая, м. горная и м. голостебельная (К.П. Глазунова, 1990). Другие исследователи к популяции ман-жетка обыкновенная относят до двенадцати видов (С.К. Черепанов,1981), также с дискретно различающимися морфологическими вариантами, при этом часто их принадлежность к группе манжетка обыкновенная не совпадает у раз-ных авторов.

Всё это затрудняет фармакогностическое изучение этих ценных лекарствен-ных растений, разработку рекомендаций по сбору сырья и его осуществление.

Недостаточность одних лишь морфологических признаков для выявления внутрипопуляционной и внутривидовой изменчивости в роде манжетка заста-вило прибегнуть к привлечению дополнительных молекулярно-биологических методов, в частности, для характеристики геномов.

Для многих других ценных лекарственных растений идентификация также не разработана на должном современном уровне, поэтому разработка методичес-ких подходов к изучению лекарственных растений с использованием молеку-лярно-биологических методов актуальна.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с научным направлением кафедры фармакогнозии и является фрагментом разрабатываемой комплексной темы: «Фармакогностическое изучение лекарственного растительного сырья, лекарственных сборов, лекарственных форм из сырья и разработка методов их стандартизации с учётом антропогенных факторов», № 01.200.110546.

Молекулярно-биологическая часть эксперимента выполнена в отделе эволю-ционной биохимии НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, по теме: «Геносистематика и молекулярная фило-генетика про- и эукариот», № госрегистации: 0187.0095927

Цель и задачи исследования. Цель исследования – разработать методичес-кие подходы к изучению лекарственных растений, обладающих аберратными формами размножения, используя молекулярно-биологические и фармакогнос-тические методы, направленные на прогнозирование перспективных сырьевых источников получения отечественных лекарственных средств. Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Определить характер изменчивости в популяциях модельного рода манжетка – Alchemilla L., с помощью полимеразной цепной реакции со случайными прай- мерами (RAPD-метод)

2. Оценить внутривидовую и популяционную изменчивость на фоне отсутствия корреляции с внешними устойчивыми морфологическими признаками его видов.

3. Изучить возможность применения характеристик геномов в фармакогности-ческом анализе. Провести сравнительное изучение с использованием RAPD-анализа лекарственных растений различных семейств, родов и разных морфо-логических групп.

4. Показать возможность использования для изучения перспективных и лекар-ственных растений секвенирования ДНК с использованием последовательнос-тей внутренних транскрибируемых спейсеров рибосомного оперона яд ДНК (ITS 1-2),хлоропластного интрона гена rps16 (rps16) и хлоропластного маркера, включающего участок экзона petB, межгенный спейсер и интрон гена petD (petB-petD) и на примере рода Аnthylis L., Провести филогенетический анализ видов рода Anthyllis и близких родов.

5. Провести изучение химического состава полифенолов и аминокислот ман-жетки, исследовать его взаимосвязь со строением геномов лекарственных рас-тений.

6. Изучить вопросы стандартизации сырья трава манжетки, разработать крите-рии идентификации (внешние и анатомические признаки, качественные харак-теристики), числовые показатели и установить их нормы.

7. Выявить природные запасы и определить урожайность травы манжетки.

8. Разработать алгоритм изучения перспективных лекарственных растений с аберратными формами размножения.

Научная новизна результатов исследования. Показана возможность при-менения молекулярно-биологических методов для фармакогностического ана-лиза. С использованием RAPD-анализа, на примере рода манжетка проведено изучение геномов перспективных лекарственных растений, определён характер изменчивости в популяциях рода и установлена генетическая дистанция между видами рода, что позволило подойти к решению проблемы внутривидовой и популяционной изменчивости.

Изучена взаимосвязь между особенностью строения геномов видов манжетки и химическим составом полифенольного и аминокислотного комплекса. Изуче-ние полифенольного и аминокислотного состава травы манжетки от разных про изводящих видов показало его сходство и позволило дать чёткие рекомендации по сбору сырья.

Показана перспективность применения молекулярно-биологических методов, RAPD-анализа и секвенирования для изучения лекарственных растений и для идентификации лекарственного растительного сырья на примере сырья расте-ний семейства розоцветные, бобовые, яснотковые, буковые, гречишные, кип-рейные, астровые.

Проведено изучение сырьевой базы травы манжетки, установлены границы полиморфизма Alchеmilla vulgaris L., что позволило определить урожайность, при ежегодных заготовках с соблюдением ресурсосберегающих условий.

Разработаны критерии оценки подлинности и качества сырья – трава ман-жетки, как перспективного лекарственного сырья для отечественной медицины.

Исследование безопасности настоя травы манжетки показало, что он может быть отнесен к группе практически нетоксических средств, так как однократ-ное введение в желудок максимально возможной дозы настоя травы манжетки не вызывало гибели животных в течение двух недель наблюдения, кроме того, выявлена его антиметастатическая активность.

Разработан алгоритм изучения лекарственных растений народной медицины, (в том числе и для - обладающих аберратными формами размножения).

Практическая значимость полученных результатов. Нами показана воз-можность применения молекулярно-биологических методов для идентифика-ции лекарственного растительного сырья.

Разработаны оптимальные методики для идентификации свежего и высу-шенного лекарственного растительного сырья с использованием RAPD-анали-за. С использованием молекулярно-биологических и традиционных фармако-пейных методов установлены характеристики подлинности и качества травы манжетки и разработаны проект Фармакопейной статьи «Трава манжетки», проект «Инструкции по сбору и сушке», а также проект Общей фармакопей-ной статьи «RAPD-анализ лекарственного растительного сырья».

Изучены сырьевая база и вопросы стандартизации сырья трава манжетки, в том числе подобрана методика количественного определения суммы флавоно-идов, определён и выделен ценный полифенол, обладающий противоопухоле-вой активностью – агримониин.

На основании изучения геномов и полифенольного комплекса для медицин-ского применения рекомендованы 12 видов рода Alchemilla L. Данные филоге-нетического анализа и ботанико-фармакогностического изучения легли в осно-ву проекта инструкции по заготовке сырья трава манжетки.

С помощью RAPD-анализа даны геномные характеристики 17-ти видам растительного сырья.





Положения, выносимые на защиту:

1. Результаты оценки сравнительного изучения геномов различных видов рода манжетка – Alchemilla L., с использованием RAPD-анализа и определение характера изменчивости.

2. Данные применения RAPD-анализа для идентификации лекарственного растительного сырья.

3. Результаты применения секвенирования ДНК лекарственных растений для их фармакогностического изучения.

4. Результаты изучения взаимосвязи строения геномов с содержанием полифе-нолов и аминокислот для изучаемых видов рода манжетка.

5. Результаты изучения запасов травы манжетки.

6. Данные по стандартизации травы манжетки.

7. Результаты разработки алгоритма изучения перспективных видов лекарст-венных растений с использованием молекулярно-биологических и фармако-гностических методов.

Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались на Российской национальной конференции «Формирование приорететов лекарст-венной политики (Москва, 28-29 июля 1995), на Первом международном сим-позиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования» (Пущино, 1-5 августа 1995), на научной конференции, посвя-щенной 50-летию ботанического сада ММА им.И.М. Сеченова (Москва, 1996), на Международном конгрессе по аналитической химии (Россия, 1997), на У и УШ Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва. 21-25 апреля 1998, и 2001), на научно-практической конференции «Традиционные методы лечения – основные направления и перспективы развития» (Москва,14-16 мая 1998), на интернациональном симпозиуме «Plant Evolution in Man-made Habitats” (Vena, August 10-15, 1998), на заседании Московского общества фито-терапевтов (Москва, ноябрь, 2000), на У1 Симпозиуме по фенольным соедине-ниям (Москва, 28-30 апреля 2004г),на научно-практической конференции «Со-временные методы стандартизации и контроля качества лекарственных средств» Москва, (30 мая 2006); на Международном конгрессе «Традиционная медицина 2007» (1-3марта 2007г).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 40 печатных работ в том числе в рецензируемых журналах - 9.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 236 страницах машинописного текста, содержит 77 ри-сунков, 38 таблиц и 3 приложения. Состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, 5 глав экспериментальных иссле-дований, общих выводов, списка литературы (250 источников, в том числе 118 на иностранных языках).

В обзоре литературы представлен анализ современного состояния проблемы изучения геномов растений, геносистематики, полиморфизма лекарственных растений показана перспективность использования молекулярно-биологичес-ких методов для решения сложных задач при изучении перспективных лекар-ственных растений, обладающих аберратными формами размножения. Охарактеризован агамно-половой комплекс Alchemilla vulgаris L.- как источ-ник ценного лекарственного сырья, его химический состав и перспективы при-менения.

Вторая глава посвящена описанию объектов исследования, методик и мето-дов анализа, использованных в работе.

В третьей главе приведены результаты применения RAPD-анализа при изу-чении самых распространённых видов рода Alchemilla, что позволило очертить круг производящих лекарственных растений для сырья – трава манжетки. Показана возможность практического применения полученных результатов по-зволивших предложить новый метод изучения лекарственных растений и ис-пользовать его для идентификации лекарственного растительного сырья.

В четвёртой главе показаны перспективы использования молекулярно-биоло-гических методов для изучения лекарственных растений: секвенирование ДНК растений (на примере рода Аnthylis L.) и RAPD-анализ различных видов сырья..

В пятой главе представлены результаты химического изучения наиболее распространенных видов рода Alchemilla и фракционное изучение полифено-лов травы манжетки, а также изучения её аминокислотного и элементного состава.

Шестая глава посвящена фамакогностическому изучению травы манжетки и практическому применению полученных результатов.

В седьмой главе представлены результаты оценки антиметастатической ак-тивности, острой и хронической токсичности водных извлечений травы ман-жетки.

В приложении представлены проекты нормативных документов по примене-нию RAPD-анализа для идентификации лекарственного растительного сырья, Иструкции по сбору и сушке травы манжетки-herba Alchemillaе, Фармакопей-ной статьи трава манжетки - herba Alchemillaе.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Объекты и методы исследования.

В качестве объектов исследования были собраны следующие виды Alchemilla L.: манжетка голостебельная - Alchemilla glabricaulus Lindb.fil., манжетка ост-ролопастная - Аlchemilla acutiloba Opiz., манжетка балтийская - Alchemilla bal-tica G. Sam.ex Juz., манжетка шерстистая - Alchemilla hirsuticaulus Lindb.fil., манжетка близкая - Аlchemilla propinqua Lindb.fil.,манжетка горная - Alchemilla monticola Opiz., манжетка семиугольная - Alchemilla heptagona Juz., манжетка изящная - Alchemila gracilis Opiz., манжетка городчатая - Alchemilla subcrenata Buser., манжетка сарматская - Alchemilla sarmatica Juz.,манжетка полулунная-Alchemilla semilunaris Alech., манжетка волнистолистная – Alchemilla cymato-phylla Juz., манжетка шаровидно-скрученная –Alchemilla conglobata Lindb.fil (A.Juzepzukii Alеch.).

Определение дикорастущих видов проводили по ключам-определителям, разработанным С.В. Юзепчуком (1939г.) и В.Н.Тихомировым (1966 г.).

Выделение ДНК. ДНК выделяли с помощью модифицированной нами методи-ки Дж. Дрейпера (1989) с использованием экстракции цетилтриметиламмония бромидом. Концентрацию ДНК оценивали с помощью спектрофотометрии или электрофореза в агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием.

Выделение ДНК и сравнение геномов сначала проводили у хорошо определя-емых видов и близких родов:манжетка (Alchemilla gracilis Opiz.) и лапчатка (Po- tentilla erecta Hampe.),а также репешок (Agrimonia eupatoria L.), собранных в Истринском районе Московской области. Там же собирали цветки таволги (Fi-lipendula ulmaria Max.) и лепестки розы (Rosa rugosa Thunb., ceм. Rosaceae), траву горца почечуйного (Polygonum persicaria L., ceм. Polygonaceae), череды трёхраздельной (Bidens tripartitus L.) и поникшей (Bidens cernuus L. ceм. Astera-ceae).

Листья дуба черешчатого и красного (Quercus robur L. и Quercus rubra L. ceм. Fagaceae) и траву язвенника (Anthylis vulneraria L.,сем. Fabaceae) собирали в ботаническом саду МГУ им.М.В.Ломоносова. Образцы других видов рода Anthylis были любезно предоставлены нам из коллекций гербариев МW, MHA, LE и др.

Цветки иван-чая узколистного (Chamaenerium angustifolium (L.) Scop. и Ch. аngustifolium var. albiflorum Hausskn., ceм. Onagraceae.) обычные и белой рассы собирали в Одинцовском районе Московской области.

Листья мяты перечной (Мentha piperita L.) и монарды двойной (Monarda di-dyma L.),траву чабреца (Thymus serpillum L.) и мелиссы (Melissa officinalis L., сeм. Lamiaceae) собирали в ботаническом саду ГОУ ВПО ММА им.И.М. Сече-нова. Цветки боярышника собирали там же с боярышника кроваво-красного (Crataegus sanquinea Pall.), а цветки боярышника кавказского (Crataegus cau-casica C. Koch.,Cratz.et Mesp.) собирали на Черноморском Побережье в Гагрин-ском районе Абхазии. Для геномного анализа использовали листья перечислен-ных выше видов манжетки, собранных в разных районах Московской области.



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |
 

Похожие работы:










 
© 2013 www.dislib.ru - «Авторефераты диссертаций - бесплатно»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.