авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ РОССИЙСКАЯ БИБЛИОТЕКА - WWW.DISLIB.RU

АВТОРЕФЕРАТЫ, ДИССЕРТАЦИИ, МОНОГРАФИИ, НАУЧНЫЕ СТАТЬИ, КНИГИ

 
<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Коксиеллез-ассоциированная инфекция крупного рогатого скота и усовершенствование лабораторных методов ее диагностики

-- [ Страница 3 ] --

2.3.2. Исследование клещей

В лаборатории после определения вида клещей, их промывали стерильным физиологическим раст­вором, отсекали конечности и из выделяющихся капель гемолимфы готовили мазки отпечатки на предметных стеклах. С этой же целью использовали извлеченный из клеща кишечник.

В результате исследований установлен довольно высокий процент (20,4%) инфицированности иксодовых клещей, из 304 проб положительными на коксиеллез оказались 62 (табл. 4).

Таблица 4 – Инфицированность коксиеллами Бернета

иксодовых клещей в Омской области

№ п.п. Вид животного Исследовано особей Положительно в РПИФ
самцы самки всего самцы самки всего
1 Dermacentor reticulatus 131 171 302 23 39 62
2 Ixodes persulcatus 1 1 2 0 0 0
Всего клещей 304 62 (20,4±2,3%)

Таким образом, основным резервуаром и переносчиками инфекции в природных стациях являются мышеобразные грызуны и иксодовые клещи, доля инфицированности которых составляет 15,5 и 20,4%, соответственно. РПИФ является простым, наиболее доступным тестом для определения инфицированности переносчиков и диких теплокровных хозяев. Метод позволяет выяснить эпизоотическую ситуацию по коксиеллезу в конкретной местности (область, район, хозяйство, пастбище).

Данные наших исследований показывают на необходимость проведения профилактических мероприятий, направленных на пути и механизмы передачи возбудителя, т.е. на уничтожение клещей и грызунов, а также на своевременность проведения профилактических и оздоровительных мероприятий на крупном рогатом скоте. Своевременное определение возбудителя в клещах и грызунах необходимое условие для проведения эпизоотологического контроля за благополучием территории по коксиеллезу.

2.4. Серологические методы диагностики коксиеллеза

2.4.1. Получение коксиеллезного антигена и

диагностической коксиеллезной антисыворотки для РНИФ

Для гипериммунизации использовали антиген, полученный из вакцинного штамма C. burnetii М-44. Вакцину разводили стандартным разбавителем до объема 1 мл. Затем стерильным физиологическим раствором доводили до концентрации 1,7x109 микробных тел в 1 мл по ОСМ ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Гипериммунизацию проводили на 2 кроликах породы шиншилла весом 2,5-3 кг.

Суть данной схемы гипериммунизации состоит в последовательном дробном внутривенном введении антигена кроликам каждые 3-4 дня в нарастающих дозах с применением иммуностимулятора левамизола подкожно при первых двух введениях антигена.

Титры антител учитывали на 7, 14, 21 и 30 сутки после введения коксиелл в РНИФ, антиген для которой готовили из этого же штамма и использовали после прогревания в водяной бане при 70оС в течение 30 мин в концентрации 0,85 млрд. м.т., т.к. было установлено, что при данной концентрации антигена реакция более демонстративна.

Таблица 5 – Динамика синтеза антител у кроликов,

гипериммунизированных коксиеллезным антигеном

Сроки взятия крови (дни) Титр антител
1 кролик 2 кролик
7-й день 1:40 1:40
14-й день 1:160 1:320
21-й день 1:320 1:640
30-й день 1:1280 1:1280


Установлено, что на 7-й день после первого введения антигена антитела в РНИФ выявлялись в низких титрах 1:40. На 14-й день положительная реакция в РНИФ была при более высоких разведениях в пределах 1:160-1:320, на 21-е сутки – 1:320-1:640, а к 30-му дню синтез антител достиг максимального уровня 1:1280 (табл. 5).

2.4.2. Контроль на чувствительность, специфичность и

активность коксиеллезной сыворотки в РНИФ

Для изучения чувствительности, видовой специфичности и активности использовали кроличьи коксиеллезные сыворотки в разведениях: с 1:10 до 1:5120, коксиеллезный антиген, полученный выше описанным способом и гетерологичные антигены: микоплазмозный, бруцеллезный, хламидиозный, листериозный, лептоспирозный, ИРТ-ПВ. Сыворотка, полученная путем гипериммунизации кроликов коксиеллезным антигеном, с разведения 1:10 была строго специфична к коксиеллезному антигену с высоким уровнем активности антител в титре 1:1280.

Преимущество данного способа в получении в короткие сроки противококсиеллезной сыворотки с высоким диагностическим титром антител. Кроличьи сыворотки могут использоваться для индикации коксиелл из биоматериала от крупного рогатого скота, клещей, мышеобразных грызунов и патологического материала от погибших и вынужденно убитых животных, а полученный антиген – для обнаружения риккетсиозных антител в сыворотке крови больных и реконвалесцентов.

2.4.3. Сравнительное изучение РНИФ и РПИФ при

коксиеллезе крупного рогатого скота в производственных

условиях

С целью испытания полученной нами кроличьей коксиеллезной сыворотки для РНИФ и стандартной люминесцентной коксиеллезной сывороткой института им. Н.Ф. Гамалеи для РПИФ в сравнительном аспекте были проведены исследования проб молока и цервико-вагинальной слизи от коров дойного стада, принадлежащих хозяйствам Омской области: ЗАО «им. Розы Люксембург» Любинского района и ОПХ «Боевое» Исилькульского района. Постановку реакций проводили согласно общепринятым методикам. С целью определения чувствительности сывороток исследуемый материал (молоко и слизь) разводили физ. раствором, начиная с 1:2. Обобщенные данные по двум хозяйствам представлены в табл. 6.

В результате исследования 50 проб молока из ОПХ «Боевое» в РНИФ и в РПИФ реагировало 5 проб (10%). Однако чувствительность РНИФ в большинстве случаев была в 2 и 4 раза выше, чем в РПИФ. Так РНИФ выявляла антигены коксиелл в молоке в разведениях 1:4-1:64, а РПИФ 1:2-1:16.

При проведении исследований 90 проб молока из ЗАО «им. Розы Люксембург»в РПИФ реагировало 22 пробы (19%), при среднем титре антигенов в молоке 1:8, а в РНИФ – 35 проб (29%), при среднем титре 1:16. При исследовании 20 проб цервико-вагинальной слизи также установлено, что полученная нами сыворотка не только не уступает стандартной люминесцентной коксиеллезной сыворотке, но и позволяет выявлять больше животных в непрямом варианте флуоресцирующих антител с низкой концентрацией коксиелл: в РНИФ реагировало 5 проб (25%), а в РПИФ 4 пробы (20%).

Таблица 6 – Чувствительность РНИФ и РПИФ по результатам исследования

на коксиеллез молока и цервико-вагинальной слизи от коров

№ п.п. Биоматериал, количество проб Положительно, %
РНИФ РПИФ
1 Молоко, 140 19,5 14,5
2 Слизь, 20 25 20
3 Всего, 160 21,3±3,2 16,3±2,9

Таким образом, в сравнительном аспекте нами установлено, что полученная коксиеллезная сыворотка обладают специфичностью, высокой чувствительностью и активностью в РНИФ и не только не уступает стандартной люминесцентной коксиеллезной сыворотке, но и позволяет больше выявлять реагирующих животных в непрямом варианте флуоресцирующих антител с низкой концентрацией антигена в титрах 1:32-1:64. При этом в РНИФ дополнительно к РПИФ выявляется на 5% больше реагирующих животных.

2.4.4. Изготовление коксиеллезного эритроцитарного диагностикума для РНГА

Для получения диагностикума в качестве клеточной основы были выбраны эритроциты барана, а для стабилизации 20%-й раствор формальдегида.

Конструирование коксиеллезного эритроцитарного диагностикума (КЭД) осуществляли в несколько этапов:

  1. дробная формалинизация эритроцитов барана,
  2. получение антигена из вакцинного штамма C. burnetii М-44,
  3. сенсибилизация формалинизированных эритроцитов барана коксиеллезным антигеном.

Постановку РНГА проводили по следующей методике: испытуемые сыворотки, после освобождения от неспецифических гемагглютининов путем инактивации в течение 20 минут при 56C, разводили в двукратной последовательности фосфатно-буферным раствором (рH-7,2), начиная с 1:10. К каждому разведению добавляли по одной капле (0,05 мл) коксиеллезного эритроцитарного диагностикума, тщательно перемешивали встряхиванием и оставляли при комнатной температуре на 1,5-2 часа. Реакцию оценивали по четырехкрестной системе. Конечным титром считали последнее разведение сыворотки, дающее гемагглютинацию на три креста.

2.4.5. Изучение специфичности и активности КЭД в РНГА

Для контроля чувствительности и активности полученного эритроцитарного диагностикума проводили постановку РНГА. Реакцию ставили макрометодом в объеме 0,5 мл в полистироловых планшетах с коксиеллезными сыворотками кроличьей и крупного рогатого скота, начиная с разведений 1:10 и 1:50 соответственно. В качестве разбавителя применяли фосфатный буфер с рН-7,2. В качестве контроля использовали этот же буфер и заведомо отрицательные на коксиеллез сыворотки кролика и крупного рогатого скота.

С коксиеллезными антисыворотками полученный диагностикум реагировал на три креста до разведения 1:1280 с кроличьей и 1:800 с сывороткой крупного рогатого скота. С отрицательными сыворотками отмечалась положительная реакция до разведений 1:20 и 1:200 соответственно. В контроле с буферным раствором четко выраженная отрицательная реакция наблюдалась во всех разведениях (табл. 7).

Для контроля специфичности полученных серий коксиеллезного эритроцитарного диагностикума ставили РНГА с гетерологичными сыворотками. КЭД в РНГА не вызывает перекрестных реакций с бруцеллезной, пастереллезной, лептоспирозной, листериозной, сальмонеллезной и хламидиозной гетерологичными сыворотками, во всех разведениях РНГА была отрицательная при четко выраженных положительных реакциях с гомологичными коксиеллезными сыворотками. Поэтому за диагностический (патологический) титр принимали разведение 1:40 и выше для кроличьей сыворотки и 1:400 для крупного рогатого скота.

Таблица 7 – Активность КЭД в РНГА

Титр сыво-ротки Сыворотка кроличья ФБР Титр сыво-ротки Сыворотка КРС ФБР
нега-тивная коксиел-лезная нега- тивная коксиел-лезная
1:10 ++++ ++++ 1:50 ++++ ++++
1:20 +++ ++++ 1:100 +++ ++++
1:40 ++++ 1:200 +++ ++++
1:80 ++++ 1:400 ++++
1:160 ++++ 1:800 ++++
1:320 ++++ 1:1600 ++
1:640 ++++ 1:3200 +
1:1280 +++ 1:6400
1:2560 ++ 1: 12800




Таким образом, полученный коксиеллезный эритроцитарный диагностикум специфичен и обладает достаточной активностью в РНГА при коксиеллезе крупного рогатого скота. Его можно использовать для обнаружения антител к коксиеллам в сыворотке крови больных и носителей. За диагностический титр в РНГА нами было принято разведение испытуемой сыворотки 1:400.

2.4.6. Изучение в сравнительном аспекте диагностической

ценности РНИФ и РНГА в производственных условиях

Для изучения чувствительности серологических методов: РНИФ с полученным коксиеллезным антигеном (КА) и РНГА с коксиеллезным эритроцитарным диагностикумом (КЭД) были проведены исследования сыворотки крови (поступающей в Омскую областную ветеринарную лабораторию, а также взятые нами пробы) из ряда хозяйств Омской области (табл. 8).

На основании результатов исследований в ряде хозяйств было установлено отсутствие инфицированных животных, в то же время в таких хозяйствах как ЗАО «Россия» Любинского района, КФХ «Зайцева» Тевризского района, в селе Красноедсово Тюкалинского района зарегистрирован высокий процент скота, содержащих антитела к коксиеллам.

Таблица 8 – Диагностическая ценность комплекса серологических методов (РНИФ и РНГА) исследований на Ку-лихорадку

в производственных условиях

№ п.п Хозяйства (Район) Кол-во проб Реагировало положительно, %.
РНИФ РНГА
1 Шанс (Саргатский) 40
2 Лузинское молоко (Омский) 50
3 Алексеевское (Горьковский) 44 5
4 Нива (Павлоградский) 182 5 5
5 Овцевод (Марьяновский) 60 3 3
6 Мол. з-д Кормиловский (Кормиловский) 50
7 Россия (Любинский) 75 63 65
8 Кольчугинский (Тарский) 10
9 Нагорный (Тарский) 10
10 Креванполе (Тарский) 10
11 КФХ Зайцева (Тевризский) 20 30 25
12 гражд. с. Красноедсово (Тюкалинский) 30 37 30
13 Ярковское (Усть-Ишимский) 20
14 им. Розы Люксембург (Любинский) 20 5 5
15 Боевое (Исилькульский) 10
16 КП-13 (Омский) 50 4
Всего 681 9,8±1,1 8,6±1,1


Pages:     | 1 | 2 || 4 |
 

Похожие работы:








 
© 2013 www.dislib.ru - «Авторефераты диссертаций - бесплатно»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.