авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ РОССИЙСКАЯ БИБЛИОТЕКА - WWW.DISLIB.RU

АВТОРЕФЕРАТЫ, ДИССЕРТАЦИИ, МОНОГРАФИИ, НАУЧНЫЕ СТАТЬИ, КНИГИ

 
<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 6 |

Функциональная и рецепторная характеристика белков суперсемейства иммуноглобулинов в процессе онто- и иммуногенеза у животных

-- [ Страница 3 ] --

Примечание. Р<0,01, * - р<0,05, n=100

Как видно из таблицы 2, содержание иммунокомпетентных клеток с Е-розеткообразующим рецептором выше в крови (21,0%), лимфатических узлах (54,5%) и селезенке (25,2%), чем уровень CD2-клеток (11,3%, 33,3%, 10,7% соответственно). Степень сопряженности между иммунологическими параметрами Т- и В-клеток, определяемых в РО и РИФ, установлена при высоких значениях коэффициента корреляции.

Оптимизированы методы антигенного розеткообразования (А-РО), теофиллиновый тест, реакция контактного взаимодействия тимоцитов и макрофагов (РКВ) на лабораторных животных, позволяющие изучать механизмы формирования иммунного ответа на антигены различной природы.


Разработка способа идентификации В-лимфоцитов

К важнейшим рецепторам В-клеток относятся sIg, специфичные к одному определенному эпитопу антигена. Известно, что на поверхности В-лимфоцита экспрессируется мембранный IgM (sIgM), являющийся неотъемлемой частью рецепторного комплекса В-клетки для антигена. Изучение форм локализации и плотности распределения sIg на поверхности В-клеток крупного рогатого скота у молодых и взрослых животных является перспективным направлением исследований механизмов клеточной активации и анергии в процессах онто- и иммуногенеза. Возможно, что белки IgSF, функционирующие на поверхности мононуклеарных клеток (МНК) и в циркулирующей крови, образуют своеобразную систему иммунного контроля поверхности не только иммуноцитов, но и клеток нервной и эндокринной систем.

Для изучения локализации sIg клетки и определения количества В-лимфоцитов был оптимизирован метод иммунопероксидазного окрашивания (ИПО) клеток с использованием моно- и поликлональных антител к Ig крупного рогатого скота и мышей. Было показано, что высокочувствительный метод ИПО является оптимальным для детального исследования модуляции Ig-рецепторов, функционирующих как в мембранной (sIg) так и в цитоплазматической (cIg) формах. SIg, cIg и секретируемые (Ig) белки IgSF, являются также показателем уровня дифференцировки В-лимфоцитов.

При постановке метода ИПО для раcщепления пероксидазы и визуализации реакции применяли 3-амино-9-этилкарбазол (АЭК). При учете результатов к sIg-МНК относили лимфоциты с окрашенной мембраной, а к cIg-МНК – клетки с окрашенной цитоплазмой.

При апробации разработанного метода на мышах и анализе полученных результатов было установлено, что относительное содержание окрашенных клеток в костном мозге распределялось следующим образом: 22,3% - сIgМ, 27,5% - cIgG и 20,5% - сIgА, 10,3% лимфоцитов содержали sIgM-рецепторы. Эти данные подтвердили известный тезис о том, что костный мозг не только поставляет клетки-предшественники различных популяций лимфоцитов, но и одновременно является местом синтеза антител.

В тимусе обнаружено 18,2% тимоцитов с sIgM, 1,0% МНК с sIgG, 2,1% лимфоцитов c сIgА. В селезенке зарегистрировано 7,5% МНК с sIgM, 7,1% - sIgG и 6,3% - сIgА. Как вторичный лимфоидный орган селезенка является главным источником циркулирующих В-лимфоцитов. По-видимому, лимфоциты, на мембране которых выявлены IgG-рецепторы, являются В-клетками памяти.



В лимфатических узлах наблюдалось 25,2% клеток с sIgМ и 40,5% - с IgG. Показано, что IgG распределялся в клетках лимфатических узлов следующим образом 5,0% - «ринг» - равномерное распределение окраски по периметру клетки, 20,3%- «петч» - неравномерное распределение окраски, 5,2% - «кэп» - образование скопления окраски на одном из полюсов клетки и 10,0% - «петч +эндоцитоз» - неравномерное распределение окраски с поглощением скоплений окраски внутрь клетки. Разнообразие форм иммуноглобулиновых рецепторов свидетельствует об интенсивных процессах секреции антител в лимфатических узлах. До 70% фолликулов лимфатического узла содержат зародышевые центры, состоящие, в основном, из пролиферирующих В-лимфоцитов, а на МНК преобладают IgG-рецепторы.

В лимфоидной ткани кишечника зафиксировано 8,3% МНК с sIgМ; 2,6% - sIgG; 3,8% - сIgА. Следует отметить, что IgA тимоцитов, спленоцитов, лимфоцитов костного мозга и лимфоидной ткани кишечника обнаружены только в цитоплазматической форме. Таким образом, согласно полученным результатам, уровень IgA-В-лимфоцитов превышает (3,8%) количество IgG-клеток (2,6%), что согласуется с данными о том, что основными клетками, синтезирующими IgA, являются В-лимфоциты кишечника (Conley M.E., 1987, Першин Б.Б. и соавт., 2001).

Больше всего В-лимфоцитов находится в костном мозге и лимфатических узлах. При этом, у мышей в клетках костного мозга преобладают cIg, что подтверждает его важную роль в синтезе антител.

В иммунных реакциях большое значение имеет функциональное состояние фагоцитов, в частности макрофагов. В крово- и лимфотоке постоянно циркулируют антитела, проникающие через стенку сосудов проходят в различные полости организма и взаимодействующие с клетками. Нами установлено, что на перитонеальных макрофагах мыши, полученных методом адгезии на пластике и тщательно отмытых от экзогенных иммуноглобулинов, присутствуют Fc-рецепторы как к IgG - 25,0%, так и к IgM – 23,0% и к IgA – 21,0%.

Таким образом, в результате проведенных исследований был оптимизирован иммунопероксидазный метод, который впоследствии был использован для определения поверхностных структур лимфоцитов крупного рогатого скота.

Динамика ILT рецепторных клеток мышей в процессе поствакцинального иммуногенеза

В ходе превращения стволовых клеток в лимфоциты, последние приобретают поверхностные антигены CD, которые отличают их от других клеток. Клетки-предшественники лимфоцитов проходят несколько стадий деления и созревания, взаимодействуя со своим микроокружением с помощью поверхностных гликопротеинов, участвующими в передаче сигнала. Активация Т-клеток возможна как по классическому (CD3-зависимому), так и альтернативному (CD2-зависимому) пути. Блокада CD-2-зависимого способа активации приводит к нарушению иммунных процессов (Талаев В.Ю., 1999). Поэтому уровень экспрессии данных ILT- рецепторов является функционально значимым в механизме формирования иммунного ответа.


Динамика адгезивной активности лимфоцитов в процессе иммуногенеза (in vivo и in vitro)

Иммунный ответ при вакцинации имеет ряд особенностей, определяемых спектром воздействия вакцины - стимулирующим или супрессирующим. Учитывая, что иммуногенез начинается с активации клеток, а именно со структурных изменений их мембран, представляет интерес определение модуляции адгезивных молекул иммунокомпетентных клеток в процессах первичного и вторичного иммунного ответа.

Известно, что при кратковременной инкубации лимфоцитов с антигеном, к которому сенсибилизированы данные лимфоциты, происходит увеличение или уменьшение количества розеткообразующих клеток и, соответственно, изменяется число поверхностных рецепторов лимфоцитов. В нашей работе метод стимуляции лимфоцитов in vitro (антигенное розеткообразование) был использован для оценки динамики уровня розеткообразующих рецепторов лимфоцитов и макрофагов под действием вакцины в процессе иммуногенеза и определения индекса сдвига, показывающего активность иммунокомпетентных клеток.

Опытной группе белых мышей вводили подкожно по 0,2 см3 производственной вакцины против рожи свиней (Erysipelothrix rhusiopathiae) из штамма ВР (VR)-2, контрольной - 0,2 мл физиологического раствора. Одну часть мононуклеарных клеток, полученных от этих групп мышей, инкубировали с вакциной, вторую – с физиологическим раствором в течение 30 мин. при t 37оС. На 2, 7, 14 и 20 сутки после иммунизации проводили количественное определение розеткообразующих тимоцитов и спленоцитов, индекса стимуляции (ИС), характеризующих влияние вакцины на активность МНК тимуса и селезенки мышей.

Результаты опыта показали, что введение вакцины обуславливает повышение количества Т- и В-клеток в тимусе и селезенке на протяжении всего срока исследования (табл.3).

Таблица 3. Процентное содержание Т- и В- лимфоцитов у мышей в процессе поствакцинального иммунного ответа (n=100)

Показатели Сутки иммунного ответа
0 2 7 14 20
Тимоциты, %: опыт.группа контроль 7,0±0,2 15,0±0,32 66,5±1,2. 30,0±0,9 49,5±1,0. 19,5±0,2 59,0±1,4. 37,0±1,0 20,0±0,8 55,0±1,3
В-спленоциты, %: опыт.группа контроль 8,7±0,1 8,0±0,2 60,0±2,0. 32,0±1,2 30,0±1,8. 9,0±0,5 16,0±1,0 12,0±0,35 10,0±0,3 31,0±0,8

Примечание. . p< 0,05: - по сравнению с контролем, - между показателями с антигеном и без антигена.

Как видно из представленных в табл.3 данных, на 2, 7 и 14 сутки после иммунизации розеткообразующая активность лимфоцитов возрастает с 30,0% до 66,6% после инкубации с вакциной. На 20 сутки - инкубация лимфоцитов с вакциной не стимулирует розеткообразование, а наоборот, приводит к его угнетению (с антигеном 20,0%, без антигена – 55,0%).

Лимфоциты мышей контрольной группы не были активированы и короткая инкубация с антигеном in vitro не привела к изменению уровня Т- и В-лимфоцитов (ИС=1,0). Как видно из табл. 4, функциональная активность иммуноцитов наиболее выражена на 7 сутки иммунного ответа (ИС=3,3-1,9), а наименее – на 20-е (ИС < 1,0).

Сравнительный анализ полученных данных свидетельствует о том, что иммуномодулирующее влияние вакцины in vitro на активированные лимфоциты выражается в изменении количества рецепторов на поверхности Т- и В-клеток. При этом показано, что 30-минутного воздействия вакцины на интактные лимфоциты недостаточно для изменения количества CD2-молекул и рецепторов к С3-компоненту системы комплемента на поверхности клеток (ИС=1,0). Аналогичная обработка лимфоцитов, иммунизированных животных, существенно увеличивало количество розеткообразующих лимфоцитов (ИС>1,0). Полученные показатели индекса стимуляции, позволяют характеризовать влияние вакцины на лимфоциты, так величина ИС>1,0 свидетельствует о иммуностимуляции, а значение ИС< 1,0 – о снижении показателей иммунного ответа.

Таблица 4. Динамика показателей индекса стимуляции (ИС) в нагрузочном тесте с вакциной против рожи свиней из штамма ВР-2

Показатели Сутки иммунного ответа
0 2 7 14 20
Тимоциты 0,4±0,02 2,2±0,2 2,5±0,2 1,6±0,3 0,4±0,02
Т-клетки селезенки 1,0±0,03 1,2±0,2 1,9±0,3 1,5±0,1 0,7±0,03
В-клетки селезенки 1,0±0,03 1,9±0,3 3,3±0,5 1,3±0,1 0,3±0,01

Примечание. - p< 0,05, n=100.

Таким образом, вакцина, используемая в данном эксперименте, способна модулировать экспрессию CD2-молекул и рецепторов к С3-компоненту системы комплемента. Этим подтверждается важная роль CD2-рецепторов Т-лимфоцитов в клеточном иммуногенезе, как в качестве адгезивных молекул, так и молекул альтернативной активации Т-клеток.

По результатам эксперимента установлена положительная корреляция между количеством розеткообразующих тимоцитов и спленоцитов (r=0,84), а также количеством В- и Т-клеток селезенки (r=0,89). Высокие значения коэффициентов корреляции характеризуют сильную степень сопряженности между иммунологическими параметрами, что подтверждает существование межклеточной кооперации основных популяций лимфоцитов в процессе иммуногенеза. Параллельно показано, что наличие сильных корреляционных взаимосвязей свидетельствует об активации иммунной системы на фоне вакцинации.


Изменения ILT-рецепторного профиля иммунокомпетентных клеток после вакцинации

В процессе иммунного ответа осуществляется множество межклеточных взаимодействий, среди которых наиболее важным является распознавание чужеродного антигена Т-клетками, основанное на специфичности связывания пептидов молекулами МНС, расположенными на поверхности антигенпрезентирующих клеток (АПК).

С целью изучения взаимосвязи между розеткообразующей активностью Т-лимфоцитов и функциональной способностью АПК взаимодействовать с тимоцитами, использованы два варианта реакции розеткообразования – лимфоцитов с эритроцитами барана и тимоцитов с макрофагами (реакция контактного взаимодействия макрофагов (РКВ). В качестве модельных антигенов использовали живые вакцины бактериального и вирусной этиологии. В процессе иммунного ответа проводили исследования изменений адгезивных свойств перитонеальных макрофагов и рецепторной активности Т-клеток лимфоидных органов у беспородных и линии BALB/c мышей. Определяя количество эритроцитов барана (ЭБ) на поверхности клетки, лимфоциты дифференцировали на высокоаффинные -многорецепторные и неполные, малорецепторные. Клетку считали малорецепторной (мРОК), если она присоединила от 1 до 3 ЭБ, а если 6 - 9 ЭБ - многорецепторной (МРОК). Также определяли количество высокоаффинных Т-клеток и их корреляцию с показателями функциональной активности антигенпрезентирующих клеток (макрофаги) в процессе поствакцинального иммунного ответа.

Таблица 5. Показатели реакции контактного взаимодействия в процессе поствакцинального иммунного ответа

Группы животных Сутки иммунного ответа
0 1 2 3 7 10 14 21
1 (Т/ПМ) 26,0± 0,5 52,0± 0,7 70,3± 1,0 200,7± 12,0 21,0± 0,3 40,1± 0,4 21,0± 0,8 20,0± 0,7
2 (Т/ПМ) 30,5± 0,9 34,8± 0,32 212,3± 30,4 70,7± 0,91 56,1± 0,3 260,3± 35,9 125,5± 15,8 26,2± 0,4






Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 6 |
 

Похожие работы:








 
© 2013 www.dislib.ru - «Авторефераты диссертаций - бесплатно»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.