авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ РОССИЙСКАЯ БИБЛИОТЕКА - WWW.DISLIB.RU

АВТОРЕФЕРАТЫ, ДИССЕРТАЦИИ, МОНОГРАФИИ, НАУЧНЫЕ СТАТЬИ, КНИГИ

 
<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 6 |

Функциональная и рецепторная характеристика белков суперсемейства иммуноглобулинов в процессе онто- и иммуногенеза у животных

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи










ЕЗДАКОВА ИРИНА ЮРЬЕВНА


Функциональная и рецепторная характеристика белков суперсемейства иммуноглобулинов в процессе онто- и иммуногенеза у животных

16.00.03. – Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва - 2009

Работа выполнена в Государственном научном учреждении «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им.Я.Р.Коваленко»

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор

Верховский Олег Анатольевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Поляков Виктор Филиппович

доктор медицинских наук, профессор

Булычева Татьяна Ивановна

доктор биологических наук, профессор

Емельяненко Петр Алексеевич

Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины»

Защита диссертации состоится _____ __________2009 г. на заседании диссертационного совета Д.220.042.01 при ФГОУ ВПО МГАВМиБ имени К.И.Скрябина (109472, Москва, ул. Академика Скрябина, 23).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО МГАВМиБ имени К.И.Скрябина.

Автореферат разослан _____ ______________ 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

профессор Грязнева Т.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ


Актуальность темы. Иммунная система создавалась в процессе эволюции для распознавания биологических структур, опасных для жизни организма. В основе иммунных реакций лежит межклеточная кооперация трех основных популяций клеток: Т-, В-лимфоцитов и макрофагов. Эти клетки в различных комбинациях, на разных этапах иммунного ответа включаются в иммунные реакции, причем доля их участия зависит от вида инфекции (Цинкернагель Р.,2008). Принцип их действия основан на существовании рецепторов, которые могут быть связаны с клеткой или секретироваться в виде антител. Изучение рецепторных свойств и функций этих клеток предоставляет отличную возможность для оценки молекулярных факторов онто- и иммуногенеза.

В практическом аспекте оценка состояния иммунной системы основывается на количественной характеристике иммунокомпетентных клеток и антител, и является основой контроля эффективности и безопасности вакцин, иммунокорригирующих препаратов, использующихся в ветеринарии (Дамбаева С.В. и соавт.,2000, Обухова О.О. и соавт., 2004, Крапивина Е.В. и соавт.,2005, Донник И.М. и соавт.,2005, Крапивина Е.В. и соавт.,2006, Шахов А.Г и соавт,2006, Дегтярев В.П, 2006).

Следует отметить, что закономерности формирования иммунного ответа на молекулярном уровне у животных изучены недостаточно. В частности, механизмы перекрестного связывания антигена с рецепторами В-клеток, роль адгезивных молекул Т-лимфоцитов и макрофагов в трансдукции сигнала при иммунизации. Ответы на эти вопросы будут способствовать разработке эффективных и безопасных вакцинных препаратов – основу специфической профилактики болезней животных.



В-, Т-клетки несут на своей поверхности специфические рецепторы, с помощью которых их можно идентифицировать. Принципы классификации рецепторов - антигенных маркеров лейкоцитов человека, выявляемых моноклональными антителами, были сформулированы на 1-м Международном совещании в Париже в 1982 г. Эти маркеры обозначили как cluster of differentiation – символом CD и соответствующими номерами. К настоящему времени создана единая номенклатура системы CD, состоящая из более 300 дифференцировочных молекул клеток человека. 30% CD-антигенов относится к суперсемейству иммуноглобулинов (IgSF), при участии которых происходит распознавание антигенов. Они содержат общие структурные элементы и характеризуются определенной пространственной доменной организацией и статистически значимой гомологией аминокислотных последовательностей (Рабсон А.,2006, Ройт А.,2000, Бурместер Г.-Р,2007 и др.). IgSF, как одни из важнейших молекул иммунной системы обеспечивают иммунную защиту от микроорганизмов, поврежденных и генетически измененных клеток, способствуя многочисленным клеточно-функциональным связям с нервной, эндокринной и другими системами.

Наиболее иммунологически значимыми белками IgSF являются:

- иммуноглобулины (Ig), существующие в двух формах: растворимые белки (антитела) и мембраносвязанные (sIg), являющиеся поверхностными рецепторами В-лимфоцитов;

- иммуноглобулиноподобные молекулы (ILT), представляющие собой мембранные рецепторы иммунокомпетентных клеток.

Среди мембраносвязывающих белков IgSF большой интерес представляют рецепторы находящиеся на поверхности Т- и НК-клеток (CD2), макрофагов (Fc- рецепторы) и В-лимфоцитов (BCR – антигенный рецептор В-клетки). Функциональная и количественная характеристика данных белков является чувствительным маркером оценки состояния иммунной системы, определения эффективности применения вакцин и препаратов, используемых для химиотерапии и иммунопрофилактики (Ющук Н.Д., и соавт.,1994, Макарков А.И. и соавт., 1997, Иллек Я.Ю. и соавт.,2003, Кирюхин А.В. и соавт., 2003, Добротина Н.А. и соавт.,2005, Артюхов В.Г и соавт., 2006)

В настоящее время для оценки состояния иммунной системы разработан комплекс лабораторных методов, позволяющий выявлять изменения в организме на молекулярно-клеточном уровне. Прежде всего, это иммуноцитохимический анализ мембранных и цитоплазматических структур иммуноцитов (Дергачева Т.И. и соавт.,2000, Булычева Т.И. и соавт.,2000, Щеголева Л.С. и Добродеева Л.К.,2003, Haines D.M. и West K.H,2005, Саидов М.З. и соавт.,2006, Высочин И.В. и соавт.,2006). Эти и другие способы определения и характеристики IgSF послужили методологической основой наших исследований.

Цель настоящей работы – функциональная и рецепторная характеристика белков суперсемейства иммуноглобулинов в процессе онто- и иммуногенеза животных с использованием разноплановых методов оценки Т- и В- систем иммунитета.

Для достижения указанной цели в работе были поставлены следующие задачи:

- разработать способы получения препаратов для количественной оценки иммуноглобулинов изотипов G, М, А (IgG, IgM, IgA) в биологических жидкостях организма крупного рогатого скота и мышей;

- оптимизировать методы идентификации и количественного определения субпопуляций Т- лимфоцитов, В- лимфоцитов и макрофагов с помощью реакции розеткообразования (Е-РО), определения фагоцитарной активности и иммуноцитохимического анализа с использованием моноклональных антител (РИФ и ИПО);

с помощью усовершенствованных методов:

- изучить функциональные и рецепторные свойства иммунокомпетентных клеток (Т- лимфоциты, В-лимфоциты, макрофаги) мышей в процессе поствакцинального иммуногенеза;

- дать функциональную и рецепторную характеристику IgM крупного рогатого скота, находящегося в растворимой и связанной (sIgМ) формах, в различные периоды онтогенеза;

- провести оценку количественных изменений клеток, несущих рецепторные белки IgSF у различных видов животных.

Связь исследований с научной программой. Диссертация выполнена в соответствии с планом НИР ВИЭВ 01.01.05 М (МП), 01.02.01 М ГНТП «Разработать и освоить производство моноспецифических антисывороток и моноклональных антител для количественно определения уровня иммуноглобулинов в биологических жидкостях организма животных», «Разработать методы иммуноанализа на основе поли- и моноклональных антител для оценки иммунного статуса животных и иммунологической эффективности различных биологических препаратов», 02.02.11 РНТП «Изучить механизмы формирования иммунного ответа у животных в процессе онто- и иммуногенеза, разработать и усовершенствовать методы иммунологического мониторинга».

Научная новизна.

Теоретически обоснована и экспериментально подтверждена концепция комплексного подхода к оценке состояния иммунной системы в процессе онто- и иммуногенеза на основе функционально-рецепторной характеристики белков суперсемейства иммуноглобулинов.

Установлено, что рецепторный профиль иммунокомпетентных клеток определяет их функциональную активность в реакциях различного генеза.

На основании результатов проведенных исследований:

- Получен штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus.musculus, используемый для получения моноклональных антител к IgМ рогатого скота (Авторское свидетельство №1560549 от 3.01.90 г.);

- Разработан способ выделения иммуноглобулина А из молозива крупного рогатого скота (патент на изобретение №2277421 от 5 апреля 2005 г.).

- Разработан способ получения секреторного иммуноглобулина А из биологической жидкости крупного рогатого скота (патент на изобретение №2288008 от 27 ноября 2006 г.)

- Разработан метод иммунопероксидазного окрашивания клеток для количественной оценки В-лимфоцитов крупного рогатого скота на основе моноклональных антител к иммуноглобулину М (патент на изобретение №2293330 от 10 февраля 2007 г.).

Впервые определены формы локализации поверхностных иммуноглобулинов В-клеток у крупного рогатого скота в различные периоды онтогенеза и проведен корреляционный анализ содержания растворимого и мембраносвязанного IgM в периферической крови животных данного вида.

Впервые изучена динамика содержания sIgМ-клеток у коров в период плодоношения.

Определены количественные показатели Т- лимфоцитов и макрофагов, а также уровень экспрессии рецепторных белков IgSF на Т- лимфоцитах мышей в процессе поствакцинального иммуногенеза.

Практическая значимость.

Практическая значимость исследования определяется тем, что систематизированы экспериментальные данные о функционально-рецепторной характеристике IgSF, содержащие выводы по методическому подходу к изучению иммунной системы животных, а также даны конкретные научно-методические рекомендации, которые позволяют интенсифицировать исследования в области ветеринарной иммунологии

На основании результатов проведенных исследований разработаны:

- «Набор компонентов для количественного определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях крупного рогатого скота методом радиальной иммунодиффузии», утвержденным Министерством Сельского хозяйства и продовольствия РФ, ТУ№9388-0039-00008064-96, 1996 г;

- Временное наставление по применению набора компонентов для количественного определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях крупного рогатого скота методом радиальной иммунодиффузии №13-7-2/617, утвержденное Департаментом Ветеринарии МСХиП РФ от 27.05.96 г.;

- Методические рекомендации «Оценка естественной резистентности сельскохозяйственных животных», рассмотренные и утвержденные в установленном порядке Сибирским отделением РАСХН, Новосибирск, 2003 г.

Рассмотрены и утверждены в установленном порядке Отделением ветеринарной медицины РАСХН:

- Методические рекомендации по количественному определению и оценке функциональной активности иммунокомпетентных клеток животных (секция «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 20 мая 2005 г., протокол№1);

- Методические рекомендации по определению sIg В-клеток (иммунопероксидазное окрашивание) (секция «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 26.09.2008 г. протокол№2);

- Методические рекомендации «Определение поверхностных структур иммунокомпетентных клеток методом иммунофлуоресценции» (секция «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 26.09.2008 г. протокол№2).

Получена серебряная медаль на 8-ой Российской агропромышленной выставке ЗОЛОТАЯ ОСЕНЬ «За Способ получения секреторного иммуноглобулина А крупного рогатого скота» (2006 г.) и золотая медаль на 10-й «За способ определения антител в иммуноцитохимическом анализе» (2008 г.)





Автор удостоен медали «Лауреат ВВЦ» в 1998 и в 2008 гг. за разработку препаратов для оценки состояния иммунной системы животных.



Апробация работы. Основные результаты работы доложены на:

- на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 30-летию ВНИиТИБП «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», Щелково, 2000 г.; Международном симпозиуме «Биология клетки в культуре», Санкт-Петербург, 2001 г.; Международной учебно-методической и научно-практической конференции, посвященной 85-летию МГАВМ и Б им.К.И.Скрябина, 2004; научной конференции «30 лет развития современных направлений клеточной биотехнологии», Москва, ВИЭВ, 2005 г.; секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН, 2005 г.,2008 г.; Международной научной конференции «Современные проблемы клеточной биотехнологии и сохранение генетических ресурсов», Москва, 2006 г.;Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных», посвященной 100-летию со дня рождения Я.Р.Коваленко, Москва, 2006 г.; Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарии в современных условиях», посвященной 60-летию Краснодарского научно-исследовательского ветеринарного института,2006 г.; 20- 21- и 22-ой Международных ежегодных конференциях Европейского сообщества по изучению китообразных (ECS), Гдыня-2006 г., Сан-Себастьян - 2007 г., Эгмонд -2008 г.; Международной конференции «Физиология и патология иммунной системы», Москва, 2008 г.; Ученом Совете, Методической комиссии ВИЭВ, 1995-2008 г.; межлабораторном заседании научных сотрудников ВИЭВ, 2009 г.

Основные положения, выносимые на защиту:

- разработка и оптимизация методов количественной оценки иммуноглобулинов, Т- лимфоцитов, В- лимфоцитов и макрофагов;

- оценка содержания растворимой и связанной форм IgM крупного рогатого скота в различные периоды онтогенеза;

- функциональные и рецепторные свойства иммунокомпетентных ILT - клеток млекопитающих, птиц и рыб в норме и при различных антигенных воздействиях.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 39 работ в периодических изданиях, материалах научных конференций и международных форумах (12 работ в журналах, рекомендованных ВАК РФ, в том числе монография «Рецепторы иммунного узнавания у животных»).

Личный вклад соискателя. Работа выполнена соискателем самостоя­тельно, участие соавторов отражено в совместно изданных научных статьях. В выполнении отдельных этапов работы принимали участие: д.б.н., профессор, член-корр. РАСХН Ю.Н.Федоров, к.б.н. Т.А.Чеботарева, к.в.н. А.И.Жаданов, к.б.н. И.В.Третьякова, к.в.н. М.Н.Борисова. Автор приносит глубокую благодарность за оказание научно-методи­че­ской помощи научному консультанту д.б.н., профессору О.А.Верховскому, д.б.н., профессору Л.П.Дьяконову, за организацию научных исследований д.в.н., профессору В.В.Субботину, научным сотрудникам ВИЭВ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 310 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы и приложений.

Материалы диссертации иллюстрированы 29 таблицами и 55 рисунками, включающими 43 микрофотографии. Список литературы включает 379 источника, из них 206 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ


Материалы и методы исследований

Исследования выполнены в лаборатории иммунологии Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко в период 1985-2008 гг.

В качестве объектов исследования использованы различные виды животных - мыши линии BALB/c, гибриды F1 (BALB/c х DBA/2) и беспородные мыши, кролики, крупный рогатый скот, куры, серебряные караси, карпы.

Материалом для исследований служили первичные (тимус, костный мозг) и вторичные (селезенка, лимфатические узлы, пейеровы бляшки) лимфоидные органы и периферическая кровь, а также перитонеальные макрофаги лабораторных мышей. Исследования иммунного статуса проводили у рыб, доставленных из рыбхозов «Гжелка» и «Биссеровский» Московской области. Отбор проб крови крупного и мелкого рогатого скота для иммунологических исследований проводили в ЗАО «Кузнецовский» Наро-Фоминского района Московской области и на опытной базе ВИЭВ о.Лисий. Образцы крови норок и SPF-кур получены в ходе совместных исследований с сотрудниками МГАВМиБ им. К.И.Скрябина и лаб. по изучению болезней птиц ВИЭВ.

Для определения уровня иммуноглобулинов, исследований по количественной характеристике и функциональной активности иммунокомпетентных клеток использовано более 5000 проб сыворотки и цельной крови мышей, крупного рогатого скота, птиц и рыб.

При изучении поверхностных структур иммунокомпетентных клеток применяли производственную вакцину против рожи свиней из штамма ВР-2 (Щелковская биофабрика), ассоциированную вакцину против трансмиссивного гастроэнтерита («ТМК») и ротавирусной инфекции («К») свиней (опытная серия, ВИЭВ) и производственную вакцину против парвовирусного энтерита собак (АО Ветзвероцентр).

IgG и IgA из биологических жидкостей крупного рогатого скота и мышей выделяли методами гель-фильтрации и ионообменной хроматографии. Наличие и степень чистоты полученых препаратов определяли методом иммуноэлектрофореза с использованием антисыворотки к белкам крови крупного рогатого скота и мышей и методом электрофореза в полиакриламидном геле в буферной системе Laemmli U.K. (1970). Изофокусирование белков проводили в системе «Phast System» (Pharmacia, Швеция) по методике, предложенной фирмой. Иммуноблоттинг осуществляли в буферной системе H.Towbin et al (1979).

 Общая схема исследований -0

Рис.1. Общая схема исследований

Гипериммунизацию кроликов породы Шиншилла с массой 2,5-3,0 кг, проводили по методу, разработанному М.А.Мисниковой и А.Ю.Самострельским.

Реакцию двойной радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони (РДП) использовали для определения чистоты, рабочего разведения антисывороток и изотипирования антител (Фримель Х.,1979).

Уровень иммуноглобулинов в биологических жидкостях организма животных определяли методом простой радиальной иммунодиффузии – РИД (Manchini G. et al, 1965). Количественную динамику розеткообразующих клеток определяли в реакции розеткообразования (Кондрахин И.П. и соавт., 1985), теофиллиновом тесте (Караулов А.В.,2002), антигенном розеткообразовании (Лебедев К.А. и соавт.,1981).



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 6 |
 

Похожие работы:







 
© 2013 www.dislib.ru - «Авторефераты диссертаций - бесплатно»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.