авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ РОССИЙСКАЯ БИБЛИОТЕКА - WWW.DISLIB.RU

АВТОРЕФЕРАТЫ, ДИССЕРТАЦИИ, МОНОГРАФИИ, НАУЧНЫЕ СТАТЬИ, КНИГИ

 
<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:   || 2 | 3 |

Выделение продуцента альфа-специфичной циклодекстринглюканотрансферазы из природных источников и разработка технологии ферментного препарата на его основе

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

СТРОЕВА СВЕТЛАНА СЕРГЕЕВНА

ВЫДЕЛЕНИЕ ПРОДУЦЕНТА АЛЬФА-СПЕЦИФИЧНОЙ ЦИКЛОДЕКСТРИНГЛЮКАНОТРАНСФЕРАЗЫ ИЗ ПРИРОДНЫХ ИСТОЧНИКОВ И РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА НА ЕГО ОСНОВЕ

Специальность 05.18.10 - Технология чая, табака и биологически активных

веществ и субтропических культур

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва – 2006

Работа выполнена на кафедре «Биотехнология» Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский Государственный Университет пищевых производств»

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор Иванова Людмила Афанасьевна
Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор Кривова Анна Юрьевна кандидат технических наук, доцент Чурмасова Людмила Алексеевна

Ведущая организация: Общество с ограниченной ответственностью «Биофлора»

Защита состоится: « 07 » декабря 2006 г. в 10.00 час. в ауд. III-101 на заседании диссертационного совета Д.212.148.04 при ГОУ ВПО «Московский Государственный Университет пищевых производств» по адресу: 125080, Москва, Волоколамское шоссе, д. 11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО МГУПП.

Отзыв на автореферат в двух экземплярах, заверенный печатью учреждения, просим направлять по адресу: 125080, Москва, Волоколамское шоссе, д. 11, МГУПП, ученому секретарю диссертационного совета Д.212.148.04.

Автореферат разослан « 03 » ноября 2006 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, д.т.н., проф. Крюкова Е. В.

  1. Общая характеристика работы.

Актуальность темы. Циклодекстринглюканотрансфераза (ЦГТ – аза, 1,4- альфа- D – глюкан- 4- альфа (1,4- альфа - глюкано) – трансфераза, К.Ф. 2.4.1.19) – фермент микробного происхождения, при воздействии которого на крахмал и аналогичные субстраты образуются циклические нередуцирующие декстрины различных размеров. В зависимости от количества альфа - D- глюкопиранозных остатков (6, 7 и 8), циклодекстрины обозначаются соответственно как альфа -, бета - и гамма - циклодекстрины (ЦД).

Синтезируемые ЦГТ – азами ЦД, вследствие уникального строения (гидрофильная поверхность и гидрофобная внутримолекулярная полость), способны образовывать комплексы – включения с различными органическими и неорганическими молекулами, изменяя их физико-химические свойства, за счет чего можно достичь таких эффектов, как увеличение в десятки и сотни раз растворимости в воде неполярных соединений, увеличение стабильности различных веществ к воздействию кислорода, воздуха, света, температуры. Благодаря этому ЦД широко используются в медицинской, фармацевтической, косметической, пищевой промышленности, сельском хозяйстве и других областях.





В промышленных масштабах ЦД можно получать лишь ферментативным путем, так как синтез этих соединений химическими методами очень дорог. В целом процесс получения ЦД сводится к следующим основным этапам: 1) культивирование микроорганизма – продуцента ЦГТ – аз, 2) выделение ферментного препарата из культуральной жидкости, 3) получение ЦД с помощью препарата ЦГТ–аз. В настоящее время выпуском ЦД заняты фирмы в различных странах мира. Стоимость бета - ЦД, промышленного производства, достигает 25 долларов США за килограмм, альфа - и гамма- ЦД имеют себестоимость в десятки раз более высокую.

Биохимические реакции, катализируемые ЦГТ – азами, очень сложны. При гидролизе субстрата (крахмала) с помощью ЦГТ – аз, может образовываться смесь альфа -, бета - и гамма - ЦД, линейных и разветвленных ЦД, моно –, ди – и три – сахаридов. В соответствии с преобладанием определенного вида ЦД в реакционной смеси ЦГТ – азы подразделяют на альфа -, бета - и гамма - специфичные.

В настоящее время в России производство ЦГТ-аз и ЦД отсутствует. В 80-е годы прошлого века в МГУПП под руководством профессора И.М.Грачевой были разработаны основы лабораторного культивирования продуцентов ЦГТ-аз. В связи с изменениями социального, политического и экономического характера в начале 90-х годов эти исследования были приостановлены. Однако во всех высокоразвитых странах интерес к комплексам включений на основе ЦД только возрастает. Поэтому разработка новых научно-обоснованных биотехнологий производства ЦГТ-аз и ЦД актуальна и перспективна.

Цель и задачи исследования. Основная цель диссертационной работы состояла в поиске активного продуцента альфа-ЦГТ-азы, оптимизации условий его культивирования для биосинтеза фермента и в получении очищенного ферментного препарата альфа-ЦГТ-зы Г10Х.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

  • скрининг микроорганизмов-продуцентов ЦГТ-аз, выделенных из природных мест обитания, и коллекционных культур, с целью отбора штамма, обладающего преимущественно альфа-ЦГТ-азной активностью;
  • идентификация штамма-продуцента альфа-ЦГТ-азы на основании изучения совокупности его морфологических, культуральных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик;
  • подбор оптимального состава питательной среды и условий культивирования на основе изучения физиолого-биохимических особенностей штамма-продуцента;
  • установление влияния микроэлементов и стимулятора роста микроорганизмов Гипоксена на накопление и активность альфа-ЦГТ-азы штамма-продуцента;
  • разработка технологии получения ферментного препарата альфа-ЦГТ-азы Г10Х.

Работа выполнялась в рамках государственного контракта с Федеральным Агентством по науке и инновациям от 28 марта 2005 г № 02.434.11.3007 по теме: ЖС-12.4/004 «Ферментные системы и технологии получения цикло­декстринов».

Научная новизна работы. На основе анализа экспериментальных данных и выявленных зависимостей накопления бациллярным штаммом альфа-ЦГТ-азной активности от условий культивирования и выхода фермента, от параметров выделения и очистки, разработана биотехнология ферментного препарата альфа-ЦГТ-зы. Для создания основ биотехнологии альфа-ЦГТ-зы было произведено следующее:

  • Проведен экспресс-скрининг микроорганизмов, выделенных из различных видов почв и коллекций культур. Получен новый штамм-продуцент с высокой альфа-ЦГТ-азной активностью, одним из уникальных свойств которого является устойчивость к высоким концентрациям солей натрия.
  • На основании изучения совокупности морфологических, культуральных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик исследуемой культуры, новый галофильный штамм, продуцирующий альфа-ЦГТ-азу, идентифицирован как Paenibacillus macerans 1АМБ.
  • В результате изучения физиолого-биохимических особенностей нового продуцента подобраны: оптимальный состав питательной среды и условия культивирования.
  • Установлено влияние микроэлементов и стимулятора роста полифенольной природы Гипоксена на накопление и активность альфа-ЦГТ-азы штамма Paenibacillus macerans 1АМБ, определены параметры его внесения в процессе культивирования.
  • На основании выявленных зависимостей накопления альфа-ЦГТ-азы в культуральной жидкости Paenibacillus macerans от условий культивирования и сохранения ее активности при концентрировании и очистке разработана технологическая схема получения ферментного препарата альфа-ЦГТ-азы Г10Х.

Практическая значимость и реализация результатов работы.

В результате скрининга почвенных ЦГТ-активных изолятов бактерий создана лабораторная коллекция микроорганизмов, секретирующих альфа-специфичные ЦГТ-азы. На основе наиболее перспективного штамма коллекции Paenibacillus macerans 1АМБ разработана биотехнология получения препарата альфа-ЦГТ-азы Г10Х. Разработаны паспорт штамма Paenibacillus macerans 1АМБ и Технические условия на ферментный препарат альфа-циклодекстринглюканотрансфераза Г10Х. С учетом выявленных в лабораторных исследованиях зависимостей выхода ЦГТ-азы от условий выделения, концентрирования и сушки, разработан Лабораторный регламент по производству ферментного препарата альфа-циклодекстринглюканотрансферазы Г10Х. Проведена наработка препаратов альфа- ЦГТ-азы различных степеней очистки (Г3Х, Г10Х) в условиях опытного производства. Полученные результаты подтверждены актом ОАО “Биохиммаш”. Изучены термо- и рН стабильность экспериментальных партий препарата альфа- ЦГТ-азы, показавшие перспективность его использования для получения ЦД.

Подана заявка на выдачу патента РФ на штамм бактерий Paenibacillus macerans 1 АМБ – продуцент альфа-ЦГТ-зы.

Апробация работы. Основные положения работы докладывались на Российских и международных конференциях и симпозиумах: Всероссийской научно-технической выставке-конференции «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» (Москва 2005); На Третьем международном симпозиуме «Микробные биокатализаторы и перспективы развития ферментных технологий в перерабатывающих отраслях АПК» (Москва 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, подана 1 заявка на патент РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, включающего 205 источников, и 7 приложений. Работа изложена на 200 страницах машинописного текста, включает 39 таблиц и 16 рисунков.

  1. Обзор литературы

В литературном обзоре рассмотрено общее состояние проблемы создания производств ЦД и ЦГТ-аз в России. Приведены строение, свойства циклодекстринов и циклодекстринглюканотрансфераз и перспективы их практического использования в пищевой, фармацевтической промышленности, биотехнологии, химии, медицине и сельском хозяйстве. Описаны реакции, катализируемые ЦГТ-азами, основные продуценты данных ферментов, принципы выбора продуктивных штаммов для процессов получения ЦГТ-аз и влияние условий культивирования на биосинтез ЦГТ-аз различными микроорганизмами. Рассмотрены способы получения ЦД с помощью ЦГТ-аз.

Анализ данных литературы выявил проблемы, существующие в данной области, и позволил сформулировать цель и задачи настоящего исследования.

  1. Экспериментальная часть
    1. Материалы и методы исследований

Микроорганизмы. В работе была использована лабораторная коллекция продуцентов ЦГТ-аз, выделенных из природных мест обитания сотрудниками кафедры “Биотехнология” Московского Государственного Университета пищевых производств и Института биологии Уфимского научного центра РАН, а также типовые культуры рода Bacillus и Micrococcus из коллекции кафедры “Биотехнология” Московского Государственного Университета пищевых производств и из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика.

Образцы почвы для скрининга. В качестве природных источников изолятов бактерий в настоящей работе использовали образцы почв Московской, Волгоградской, Воронежской и других областей России, ближнего и дальнего зарубежья. С момента отбора материал хранили при температуре (+2) – (+7)0С в течение 1-3 месяцев.

Скрининг ЦГТ-активных микроорганизмов из природных мест обитания и из коллекции культур МГУПП. Экспресс-скрининг микроорганизмов - продуцентов ЦГТ-аз, выделенных из природных мест обитания, проводили согласно схеме, разработанной сотрудниками Института биологии Уфимского научного центра РАН, с введением некоторых модификаций (Терехова Е. Я., 1999).

Питательные среды.

Среды для хранения и поддержания штаммов. Микроорганизмы из коллекции культур МГУПП хранили в пробирках при температуре 4°С на различных агаризованных средах: мясопептонный агар (МПА), питательная среда ГРМ для выращивания бактерий (на основе гидролизата рыбной муки), картофельный агар. Штаммы микроорганизмов, выделенные из почв, хранили на среде «В» следующего состава, г/дм3 : глюкоза – 1, пептон – 1, MgSO4 – 0,4, KH2PO4 – 0,4, агар – 2, pH среды после стерилизации – 7,2 – 7,4.

Среды, используемые при проведении скрининга. Среда «А», г/дм3: крахмал – 10; пептон – 3; дрожжевой экстракт – 3; кукурузный экстракт – 3; агар – 18; Na2HPO4 – 2; KH2PO4 – 2; pH сред после стерилизации – 7,4 – 7,6. Среда «Б», г/дм3: крахмал – 10; пептон – 3; дрожжевой экстракт – 3; кукурузный экстракт – 3; CaCO3 – 5; pH сред после стерилизации – 7,4 – 7,6.

Среды, используемые для проведения идентификации бактерий. Для идентификации бактерий использовали питательные среды производства ФГУП ГНЦ ПМ, п. Оболенск.

Морфология клетки. Морфологию, подвижность и размеры клеток исследовали с помощью фазовой оптической микроскопии на микроскопах МИКМЕД 5, БИОЛАМ И.

Фенотипическая характеристика. Изучение морфологических и физиолого-биохимических характеристик выделенных культур проводили, руководствуясь общей стратегией фенотипической дифференциации, описанной в руководствах: «Определитель бактерий» (Bergey’s manual, 1997), «Методы общей бактериологии (Герхард, 1983).

Определение последовательностей гена 16S pРНК.

Последовательности 16S pРНК генов были получены методом ПЦР. ПЦР проводилась на ДНК-амплификаторе GeneAmp PCR System 2700 фирмы Applied Biosystem в Центре “Биоинженерия” РАН.

Качественное определение альфа-ЦГТ-азной активности штаммов продуцентов, выращенных на тест-средах проводили модифицированным методом Тильдена-Хадсона (Tilden E.B., Hudson C.S., 1942; Терехова Е. Я., 1999).

Количественный метод определения активности альфа-ЦГТ-азы проводили по методу методу Мякеля-Лааксо (M. J. Makela, S.V. Laakso, 1988).

Измерение активности бета-ЦГТ-азы.

Измерение активности бета-специфичной ЦГТ-азы проводили спектрофотометрически – модифицированным фенолфталеиновым методом (Терехова Е. Я., 1999).

ВЭЖХ - анализ продуктов ферментативной конверсии крахмалов проводили на колонке «SEPARON-NH2» (размер – 4,6х250 мм, скорость подачи элюента 0,8 см3/мин, элюент – 60% водный ацетонитрил) в Центре “Биоинженерия” РАН.

Декстринирующую активность ЦГТ-азы определяли модифицированным методом Фува, основанным на измерении падения поглощения при определенной длине волны, связанного с изменением окраски йодного комплекса с крахмалом после окончания ферментативной реакции (Nakamura N., Horikoshi K., 1976).

Статистическую обработку экспериментальных данных, полученных не менее, чем в 3-х повторностях, проводили по программе Excel 2003 Microsoft Office.

Результаты исследований и их обсуждение

3.2.1. Скрининг ЦГТ-активных микроорганизмов из природных мест обитания и из коллекции культур МГУПП

Для получения высокоактивного продуцента альфа-ЦГТ-азы из 150 образцов почвы, отобранных из различных мест обитания (Европейская часть России, Крым, Израиль, Турция, Египет и др.) выделены 120 изолятов, осуществляющих деструкцию крахмала. Каждый изолят был подвергнут анализу на специфичность с помощью модифицированного теста Тильдена – Хадсона. Анализ показал, что 10 штаммов оказались бета - ЦГТ-активными, 15 штаммов альфа -ЦГТ-активными и 12 штаммов обладают смешанной альфа+ бета – специфичностью.

С целью выбора активных продуцентов ЦГТ-аз из коллекции кафедры “Биотехнология”, было проверено 55 культур из рода Bacillus и рода Micrococcus. Для обнаружения ЦГТ-азной активности культуральную жидкость исследуемых культур подвергали модифицированному тесту Тильдена – Хадсона и по характеру кристаллообразования судили о специфичности исследуемых культур. Анализ показал, что 10 штаммов оказались бета-ЦГТ-активными, 3 штамма альфа-??ЦГТ-активными и 2 штамма обладают смешанной альфа-?+ бета - специфичностью.

Таким образом, в результате проведенного скрининга для дальнейших исследований отобрано 18 штаммов микроорганизмов, секретирующих преимущественно альфа-ЦГТ-азу. С целью выбора наиболее активного продуцента все альфа – специфичные штаммы выращивали на среде состава “Б” с определением декстринирующей и альфа- и бета-циклизующей активностей по окончании культивирования. Культивирование осуществляли в течение 72 ч при 30 ±1С в колбах объемом 750 см3 со 100 см3 питательной среды на качалочной установке при n=180 об/мин.

Результаты определения декстринирующей и альфа- и бета-циклизующей активностей ЦГТ-азы в культуральных жидкостях испытанных бактериальных культур представлены в таблице 1.

Таблица 1

Декстринирующая и альфа- и бета-циклизующие активности бактериальных культур при глубинном выращивании в колбах на качалочной установке



Pages:   || 2 | 3 |
 

Похожие работы:







 
© 2013 www.dislib.ru - «Авторефераты диссертаций - бесплатно»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.