авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ РОССИЙСКАЯ БИБЛИОТЕКА - WWW.DISLIB.RU

АВТОРЕФЕРАТЫ, ДИССЕРТАЦИИ, МОНОГРАФИИ, НАУЧНЫЕ СТАТЬИ, КНИГИ

 
<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:   || 2 | 3 |

Разработка технологий гамма-циклодекстринглюканотрансферазы, гамма-циклодекстрина и комплексов включения на его основе

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Шипарева Дарья Герасимовна

Разработка технологий гамма-циклодекстринглюканотрансферазы, гамма-циклодекстрина и комплексов включения на его основе

Специальность 05.18.07 - Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата технических наук

Москва – 2011

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования

«Московский государственный университет пищевых производств»

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор

Иванова Людмила Афанасьевна

Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор

Карпенко Дмитрий Валерьевич,

кандидат биологических наук, доцент

Типисева Ирина Анриевна

Ведущая организация: ГНУ ВНИИ Пищевой биотехнологии РАСХН

Защита состоится: « __ »____________ 2011 г. в ____ ч. в ауд. ____ на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д212.148.04 при ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств» по адресу: 125080, Москва, Волоколамское шоссе, д. 11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО МГУПП.

Отзыв на автореферат в двух экземплярах, заверенных печатью учреждения, просим направлять по адресу: 125080, Москва, Волоколамское шоссе, д. 11, МГУПП, ученому секретарю диссертационного совета Д 212.148.04.

Автореферат отправлен по адресу referat_vak@mon.gov.ru для размещения в сети Интернет Министерством образования и науки РФ и размещен на сайте http://www.mgupp.ru .

Автореферат разослан « ___ » ноября 2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, к.т.н. Тимофеев Д.В.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Циклодекстрины (ЦД) – уникальная группа химических веществ, обладающих специфической функциональной активностью. Они представляют большой интерес для пищевой, фармацевтической, химической и других отраслей промышленности благодаря способности образовывать комплексы включения. ЦД используются для стабилизации летучих эфирных масел, ароматических веществ и специй, повышения устойчивости и улучшения усвояемости витаминов, пролонгирования действия лекарств, снижения их вредного воздействия, устранения нежелательного запаха и вкуса и т.д.

Поскольку синтез этих соединений химическими методами очень дорог, в промышленных масштабах ЦД можно получать лишь ферментативным путем при помощи специальных ферментов, называемых циклодекстринглюканотрансферазами (ЦГТазами). В целом процесс получения ЦД сводится к следующим основным этапам: 1) культивирование микроорганизма – продуцента ЦГТаз, 2) выделение ферментного препарата из культуральной жидкости, 3) получение ЦД с помощью препарата ЦГТ–азы.

В настоящее время выпуском ЦД заняты фирмы в различных странах мира. Бесспорное лидерство в производстве ЦД принадлежит китайским, а также японским, индийским и американским фирмам. Стоимость -ЦД, промышленного производства в зависимости от степени очистки составляет 1,5-8$ США за кг, -ЦД – 25-40$ США за килограмм и -ЦД 40-100$ США за кг.



В настоящее время в России производство ЦГТ-аз и ЦД отсутствует, хотя исследования в этом направлении проводились. Тем не менее, во всех высокоразвитых странах интерес к комплексам включений на основе ЦД только возрастает. Поэтому разработка новых научно-обоснованных биотехнологий производства ЦГТ-аз и ЦД актуальна и перспективна.

Настоящая работа посвящена разработке технологий -ЦГТазы, -ЦД и комплексов включения на основе -ЦД.

Цель и задачи исследования.

Основные цели диссертационной работы состояли в поиске нового активного продуцента -ЦГТ-азы, разработке технологии очищенного ферментного препарата -ЦГТ-зы Г10Х, получении -ЦД и комплексов включения на его основе.

Для достижения поставленных целей решались следующие задачи:

  • скрининг микроорганизмов-продуцентов ЦГТ-аз, выделенных из природных мест обитания, с целью отбора штамма, обладающего наибольшей -ЦГТ-азной активностью;
  • идентификация штамма-продуцента -ЦГТ-азы на основании изучения совокупности его морфологических, культуральных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик;
  • подбор оптимального состава питательной среды и условий культивирования на основе изучения физиолого-биохимических особенностей штамма-продуцента;
  • разработка технологии получения ферментного препарата -ЦГТ-азы Г10Х;
  • биоконверсия крахмала в циклодекстрины с помощью полученного препарата -ЦГТазы Г10Х;
  • выделение -ЦД из реакционной смеси;
  • получение комплексов включения на основе -ЦД.

Научная новизна работы.

Проведен направленный скрининг микроорганизмов, обладающих -ЦГТазной активностью, выделенных из различных видов почв.

В результате скрининга для исследований отобран штамм-продуцент -ЦГТазы с максимальной активностью (15 ед/см3). На основании изучения совокупности морфологических, культуральных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик исследуемой культуры новый штамм, продуцирующий -ЦГТазу, идентифицирован как Bacillus thuringiensis АПБ.

Впервые в РФ выделен продуцент ЦГТазы, трансформирующий крахмал преимущественно в -ЦД. На основе анализа экспериментальных данных и выявленных зависимостей накопления бациллярным штаммом -ЦГТазной активности от условий культивирования и выхода фермента, от параметров выделения и очистки, разработана биотехнология ферментного препарата -ЦГТазы.

При использовании полученного в результате скрининга нового штамма-продуцента -ЦГТазы с учетом экспериментально обоснованных зависимостей выхода -ЦД от способов предварительной обработки крахмала, разработана биотехнология получения -ЦД.

Разработаны способы получения комплексов включения -ЦД с рыбьим жиром и витаминами Е и В2 на основе молекулярных моделей и анализа физических методов обработки.

Выявлено положительное влияние процесса комплексообразования с -ЦД на устойчивость биологически активных веществ (БАВ) к воздействию света и кислорода воздуха.

Практическая значимость и реализация результатов работы.

В результате скрининга почвенных ЦГТ-активных изолятов бактерий создана лабораторная коллекция микроорганизмов, секретирующих -специфичные ЦГТ-азы. На основе наиболее перспективного штамма коллекции Bacillus thuringiensis АПБ разработана биотехнология получения препарата -ЦГТазы Г10Х.

Разработаны проекты Лабораторного регламента и Технических условий на ферментный препарат -циклодекстринглюканотрансфераза Г10Х. Проведена наработка препарата -ЦГТ-азы Г10Х в условиях опытного производства. Полученные результаты подтверждены актом ЗАО «Фармацевтическая фирма «Лекко».

Проведен расчет экономической эффективности разработанной технологии -ЦГТазы Г10х, который показал, что оптовая цена ферментного препарата находится на уровне мировых рыночных цен и составляет 2174 руб за 1 кг.

Штамм бактерий Bacillus thuringiensis АПБ депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-11066. Подана заявка на выдачу патента РФ «Штамм бактерий Bacillus thuringiensis АПБ – продуцент -циклодекстринглюканотрансферазы»

Получены комплексы включения рыбьего жира и витаминов Е и В2 с -ЦД с молярным соотношением компонентов от 1:1 до 1:5. В лабораторных условиях кафедры «Технология продуктов общественного питания» МГУПП изготовлен бисквит с добавлением комплексов витаминов Е и В2 с -ЦД. Показано, что применяемые комплексы не оказывают негативного влияния на форму, структуру и консистенцию бисквита и аромат продукции, улучшают вкус и повышают пищевую ценность получаемых продуктов, обогащая их БАВ. Результаты проведенной работы подтверждены актом лабораторных испытаний.

На заводе ОАО «Московская косметическая фабрика «Рассвет» произведена опытная партия крема, содержащего комплекс включения витамина Е с -ЦД. Добавление комплекса в состав крема не влияло на его внешний вид, цвет, запах и стабильность. Комплекс витамина Е с -ЦД позволяет предупреждать преждевременное старение кожи и снижает вредное воздействие ультрафиолетового излучения. Полученные результаты подтверждены актом.

Подана заявка на патент «Штамм бактерий Bacillus thuringiensis АПБ – продуцент -циклодекстринглюканотрансферазы» от 01.11.2011 г.

Апробация работы.

Основные положения работы докладывались на Российских и международных конференциях и симпозиумах: V Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва 2009); XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009» (Москва 2009); III Международной научно-технической конференции «Инновационные технологии и оборудование для пищевой промышленности (приоритеты развития)» (Воронеж 2009); VII Международной научно-практической конференции и выставке «Технологии и продукты здорового питания. Функциональные пищевые продукты» (Москва 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 1 заявка на патент РФ, где отражены основные положения диссертации

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, включающего 202 источника, и 11 приложений. Работа изложена на 145 страницах машинописного текста, включает 21 таблицу и 31 рисунок.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

В литературном обзоре освещена история исследования ЦД и развития их производства в мире. Рассмотрены строение и свойства ЦД и ЦГТ-аз, основные продуценты данных ферментов, приведены примеры использования ЦД в пищевой, фармацевтической и других отраслях промышленности. Описаны реакции, катализируемые ЦГТ-азами, а также способы получения ЦД с помощью ЦГТ-аз. Рассмотрены методы получения комплексов различных веществ с ЦД.

Анализ данных литературы выявил проблемы, существующие в данной области, и позволил сформулировать цели и задачи настоящего исследования.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. Материалы и методы исследований

Образцы почвы для скрининга. В качестве природных источников изолятов бактерий использовались образцы почв: Московской, Тамбовской, Псковской, Новгородской областей, Краснодарского края, а так же образцы почв, привезенные из Казахстана, Туркменистана, Вьетнама, Египта и острова Крит. С момента отбора материал хранили при температуре +4°С в течение 1-3 месяцев.

Скрининг ЦГТ-активных микроорганизмов из природных мест обитания. Скрининг микроорганизмов - продуцентов ЦГТ-аз, выделенных из природных мест обитания, проводили согласно схеме, разработанной сотрудниками Института биологии Уфимского научного центра РАН, с введением некоторых модификаций (Терехова Е. Я., 1999).

Питательные среды.

Среды, используемые при проведении скрининга. Среда «А», г/дм3: крахмал- 10,0, пептон -5,0, дрожжевой экстракт -5,0, K2HPO4 -1,0, MgSO4*7H2O -0,2, Na2CO3 -10,0. Среда «Б», г/дм3: крахмал -10,0; пептон -5,0; дрожжевой экстракт - 7,0; К2НРО4 -0,5; Nа2СО3 – 5,0; MgSO4*7H2O-0,3. Среда “В”, г/дм3: крахмал – 10,0; К2НРО4 – 0,5; пептон – 7,0; дрожжевой экстракт – 7,0; Nа2СО3 – 5,0; MnSO4*7H2O -0,3; MgSO4*7H2O -0,3.

Среды, используемые для проведения идентификации бактерий. Для идентификации бактерий использовали питательные среды производства ФГУП ГНЦ ПМ, п. Оболенск.

Морфология клетки. Морфологию, подвижность и размеры клеток исследовали с помощью фазовой оптической микроскопии на микроскопах МИКМЕД 5, БИОЛАМ.

Фенотипическая характеристика. Изучение морфологических и физиолого-биохимических характеристик выделенных культур проводили, руководствуясь общей стратегией фенотипической дифференциации, описанной в руководствах: «Определитель бактерий» (Bergey’s manual, 1997), «Методы общей бактериологии (Герхард, 1983).





Определение последовательностей гена 16S pРНК.

Идентификация проводилась путем анализа секвенсов вариабельных участков 16S рДНК, а также ПЦР анализа с использованием видоспецифических праймеров сотрудниками ФГУП «ГосНИИГенетика»..

Качественное определение -ЦГТазной активности штаммов продуцентов, выращенных на тест-средах проводили модифицированным методом Тильдена-Хадсона (Tilden E.B., Hudson C.S., 1942).

Количественный метод определения активности -ЦГТазы. Измерение активности -специфичной ЦГТазы проводили спектрофотометрически – модифицированным бромкрезоловым методом (Kato, Horikoshi, 1984).

ВЭЖХ - анализ продуктов ферментативной конверсии крахмалов проводили на колонке Shimadzu LC-20  (колонка 150x4.6 Reprosil Amino, элюент ацетонитрил-вода 65:35, скорость потока 2 см3/мин) в центре прикладных разработок в области хроматографии фирме «СКАН».

Содержание витаминов в комплексах определяли фотометрическим (КФК-3) и флуориметрическим методами (Shimadzu RF-5000).

Статистическая обработка данных проводилась с использованием программ Statistica 6.0 и Microsoft Excel 2007, в работе представлены средние результаты с достоверностью 95%.

3.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.2.1. Скрининг ЦГТ-активных микроорганизмов из природных

мест обитания

В процессе работы было получено более 400 изолятов культур, осуществляющих деструкцию крахмала. Все они были проверенны на способность к биосинтезу -ЦГТазы модифицированным бромкрезоловым методом. Все изоляты после глубинного культивирования были проанализированы на -ЦГТ-азную активность фенолфталеиновым методом. В результате проведенного скрининга для дальнейших исследований был отобран 1 -ЦГТ-активный штамм АПБ, показавший наибольшую активность 15 ед/см3

3.2.2. Исследование фенотипических признаков и идентификация штамма АПБ продуцента -ЦГТ-азы

Исследование морфологических и культуральных признаков штамма АПБ показало, что выделенный при скрининге штамм принадлежит к аэробным бактериям, образующим эндоспоры, располагающиеся в терминально и субтерминально и не раздувающие клетку. Через 24ч инкубации при 37°С обнаруживаются подвижные грам-положительные палочки размером 0,53,9 мкм. На плотной среде бактерии формируют круглые колонии диаметром от 1,0мм до 4,0мм, поверхность колоний гладкая, с полупрозрачной, блестящей кремовой структурой. Цвет колоний белый с желтоватым оттенком, профиль выпуклый, четко сформированный рост по «штриху».

Морфологические и культуральные признаки исследуемой культуры при сравнении её с тест-культурой позволяют отнести ее к бактериям рода Bacillus.

Для выявления видовой принадлежности изучались физиолого-биохимические признаки: потребление углеводов и сахаро-спиртов, отношение к кислороду, отрицательная реакция Фогес-Проскауэра, каталазная активность. На основании полученных данных установлено, что исследуемый микроорганизм принадлежит к роду Bacillus.

Для достоверности идентификации были изучены филогенетические особенности культуры. Сиквенс 16S rRNA, проведённый поиск гомологичных последовательностей с построением филогенетического дерева (рис.1) и ПЦР анализ с использованием видоспецифических праймеров показали, что выделенный нами штамм с точностью 99% относится к роду Bacillus вида thuringiensis.

 Филогенетическое дерево с-1

Рис.1. Филогенетическое дерево с гомологичными штаммами unknown – исследуемый штамм

Таким образом, на основании изучения совокупности морфологических, культуральных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик исследуемой культуры, новый штамм АПБ, продуцирующий преимущественно -ЦГТазу, идентифицирован как Bacillus thuringiensis.

3.2.3. Определение наиболее эффективного состава питательной среды для биосинтеза ЦГТ-азы Bacillus thuringiensis АПБ.

Определение наиболее эффективного состава питательной среды для глубинного культивирования Bacillus thuringiensis АПБ проводили по результатам реализации метода аддитивно-решетчатого математического описания объекта. Факторами, влияющими на эффективность биосинтеза ЦГТ-аз культурой Bacillus thuringiensis АПБ являются концентрации в питатель крахмала, пептона, КН2РО4, дрожжевого экстракта, Na2CO3, MgSO4*7H2O.

Процесс определения наиболее эффективного состава питательной среды заключался в выборе уровней каждого фактора, обеспечивших наибольший эффект. Такими уровнями оказались концентрации компонентов в среде: 1,0% крахмала, 0,5% пептона, 0,7% дрожжевого экстракта, 0,05% КН2РО4, 0,03% MgSO4*7H2O и 0,5% Na2CO3. Это сочетание уровней факторов дает результат, превышающий среднюю активность -ЦГТазы в этой серии опытов на до 16,0 ед/см3.

Таким образом, оптимальным для Bacillus thuringiensis АПБ является следующий состав питательной среды (%): крахмал – 1,0; пептон – 0,5; дрожжевой экстракт – 0,7; КН2РО4 – 0,03; Nа2СО3 – 0,5; MgSO4*7H2O – 0,03 (среда «Б»).

3.2.4. Изучение влияния микроэлементов и стимуляторов на накопление и активность -ЦГТ-азы Bacillus thuringiensisАПБ

Для изучения влияния микроэлементов на биосинтез -ЦГТаз в питательную среду добавляли следующие соли: FeSO4x7H2O; Co(NO3)2x6H20; CuSO4x5H2O; ZnSO4x7H2O, MnSO4x7H2O. Результаты показали, что наиболее высокий выход активности -ЦГТ-азы 17 ед/см3 может быть достигнут при добавлении в питательную среду соли Mn2+.

3.2.5. Изучение влияния рН исходной ферментационной среды на биосинтез -ЦГТазы бактериями Bacillus thuringiensisАПБ

Результаты исследований по изучению влияния рН ферментационной среды на биосинтез -ЦГТазы бактериями Bacillus thuringiensis АПБ представлены на рис. 2. где видно, что в диапазоне рН 9,5-10,5 достигается максимальная активность фермента. Таким образом, при культивировании Bacillus thuringiensis АПБ рН среды после стерилизации должен находиться в диапазоне 9,5-10,5.

Рис.2. Влияние рН исходной питательной среды на биосинтез -ЦГТазы

3.2.6. Разработка способов получения посевного материала Bacillus thuringiensis АПБ

В ходе экспериментов по определению требуемого возраста и дозы посевного материала Bacillus thuringiensis АПБ выращивали на среде улучшенного состава в течение 24,30,36,42 и 48ч в колбах на качалочной установке при 30°С, после чего определяли активность -ЦГТазы в нем. Затем проводили засев ферментационной среды готовым посевным материалом в количестве 1; 2; 3; 5; 7; 10% по объему. Наибольшую активность ЦГТ-азы в культуральной жидкости – 17,0 ед/см3 обеспечивает использование посевного материала Bacillus thuringiensis АПБ в возрасте 36ч и посевной дозе 5%.

2.2.7. Изучение динамики биосинтеза фермента -ЦГТазы бактериями Bacillus thuringiensis АПБ.



Pages:   || 2 | 3 |
 

Похожие работы:










 
© 2013 www.dislib.ru - «Авторефераты диссертаций - бесплатно»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.