авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ РОССИЙСКАЯ БИБЛИОТЕКА - WWW.DISLIB.RU

АВТОРЕФЕРАТЫ, ДИССЕРТАЦИИ, МОНОГРАФИИ, НАУЧНЫЕ СТАТЬИ, КНИГИ

 
<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:   || 2 | 3 |

Электрохимические холинэстеразные сенсоры на основе углеродных нанотрубок и макроциклических лигандов

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Юнусов Равиль Рэмилевич

ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ ХОЛИНЭСТЕРАЗНЫЕ СЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ УГЛЕРОДНЫХ НАНОТРУБОК И МАКРОЦИКЛИЧЕСКИХ ЛИГАНДОВ

02.00.02 – Аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

Казань – 2013

Работа выполнена на кафедре аналитической химии Химического института им. А.М. Бутлерова федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Казанский (Приволжский) федеральный университет»

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Евтюгин Геннадий Артурович

Официальные оппоненты: Евгеньев Михаил Иванович,

доктор химических наук, профессор,

профессор кафедры аналитической химии, сертификации и менеджмента качества ФГБОУ ВПО «Казанский национальный исследовательский технологический университет», г. Казань

Гоголашвили Эдуард Лаврентьевич

кандидат химических наук,

Начальник Центра химико-аналитических исследований ФГБУН «Институт органической и физической химии им.А.Е.Арбузова» КНЦ РАН

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Башкирский государственный университет», г.Уфа

Защита состоится «5» декабря 2013 г. в 14-30 на заседании диссертационного совета Д 212.081.30 при Казанском (Приволжском) федеральном университете по адресу: ул. Кремлевская, 18, Химический институт им. А. М. Бутлерова КФУ, Бутлеровская аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского Казанского (Приволжского) федерального университета.

Отзывы на автореферат просим направлять по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18, КФУ, Химический институт им. А.М. Бутлерова.

Автореферат разослан «___» _________ 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат химических наук, доцент Казымова М.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Создание средств экспресс-контроля потенциально опасных химических и биологических факторов является приоритетной задачей развития современной аналитической химии, направленное на обеспечение безопасности общества и здоровья населения. Угрозы биологического и химического терроризма, а также растущие объемы применения химических средств защиты растений заставляют интенсифицировать исследования в указанной области. Применительно к веществам нервно-паралитического действия достижение требуемых характеристик чувствительности и селективности определения токсикантов достигается, в первую очередь, с применением фермента ацетилхолинэстеразы (АХЭ). Являясь биологической мишенью для веществ нервно-паралитического действия, АХЭ реагирует на их присутствие снижением своей активности, что может быть зафиксировано различными физико-химическими методами. Несмотря на то, что механизм ингибирования АХЭ и способы регистрации ее активности в настоящее время хорошо изучены, остаются задачи обеспечения селективности отклика и повышения чувствительности определения пестицидов антихолинэстеразного действия. Их решение требует дальнейшего развития соответствующих методов регистрации сигнала, опирающихся на достижения современного материаловедения и аналитического приборостроения для подавления влияния компонентов матрицы образца и повышения чувствительности преобразователей сигнала.



Электрохимические способы регистрации сигнала холинэстеразных сенсоров выгодно отличаются от оптических методов простотой используемого оборудования, удобством реализации в виде компактных сенсоров, чувствительностью регистрации сигнала. Внедрение новых наноразмерных материалов, обеспечивающих коммуникацию биохимических и электрохимически активных компонентов, может существенно улучшить характеристики электрохимической регистрации сигнала об ингибировании холинэстераз, что расширит область контроля остаточных количеств пестицидов антихолинэстеразного действия.

Целью исследования явилось создание электрохимических холинэстеразных сенсоров для определения фосфорорганических пестицидов на основе новых наноразмерных материалов – носителей фермента и медиаторов электронного переноса, отличающихся улучшенными аналитическими и операционными характеристиками, а также их тестирование на модельных растворах фосфорорганических пестицидов и искусственных объектах анализа.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

- изучить условия регистрации сигнала – тока окисления тиохолина – с использованием стеклоуглеродных электродов, модифицированных новыми медиаторными системами – комбинированными покрытиями из окисленных углеродных нанотрубок (ОУН) и фталоцианина кобальта (ФЦК);

- определить рабочие условия иммобилизации АХЭ с применением поликарбоксилированных макроциклических носителей – производных тиакаликс[4]арена, а также углеродных наноразмерных материалов, для достижения высокой чувствительности регистрации ингибирования фермента;

- установить операционные характеристики измерения сигнала разработанных биосенсоров и аналитические характеристики определения с их помощью ацетилтиохолина (АТХ) и фосфорорганических пестицидов в зависимости от способа модификации преобразователя сигнала;

- провести тестирование модельных растворов ингибиторов и искусственных образцов загрязненных вод и фруктовых соков с помощью разработанных холинэстеразных сенсоров и определить требования к пробоподготовке образцов для учета матричного эффекта.

Научная новизна работы состоит в том, что впервые:

- предложено использовать новые медиаторные системы на основе композиций углеродных материалов (ОУН и углеродная сажа (УС)) и ФЦК для снижения рабочего потенциала окисления тиохолина;

- разработаны способы иммобилизации АХЭ на макроциклических поликарбоксилированных носителях на тиакаликс[4]ареновой основе;

- проведено систематическое исследование влияния строения поверхностного слоя (природа медиатора и носителя фермента) и установлено влияние конфигурации макроциклического носителя и строения заместителей на кинетику ингибирования и операционные характеристики холинэстеразных сенсоров;

- проведено систематическое исследование аналитических характеристик определения фосфорорганических пестицидов с помощью биосенсоров, различающихся по способу модификации поверхности и иммобилизации фермента;

Практическая значимость работы состоит в том, что:

- разработаны простые и надежные способы модификации электродов углеродными материалами, ФЦК и макроциклическими поликарбоксилированными носителями фермента, обеспечивающими быстрый отклик и высокую точность измерения сигнала биосенсоров на субстрат и ингибиторы фермента;

- предложены высокочувствительные способы определения фосфорорганических соединений – ингибиторов фермента – с хроноамперометрической регистрацией сигнала;

- разработаны способы пробоподготовки для снижения влияния компонентов матрицы при количественном определении пестицидов в водах различного назначения и для обнаружения веществ антихолинэстеразного действия в свежевыжатых фруктовых соках.

На защиту выносятся:

- результаты модификации стеклоуголеродных электродов углеродными наноматериалами и ФЦК, позволяющей снизить рабочий потенциал окисления тиохолина до 50 - 150 мВ при сохранении высокой скорости отклика и отсутствии отравления электрода тиольными соединениями;

- условия карбодиимидной ковалентной иммобилизации АХЭ на модифицированных преобразователях сигнала, обеспечивающие уменьшение расхода фермента и увеличение чувствительности определения фосфорорганических пестицидов за счет сохранения высокой диффузионной проницаемости слоя для субстрата и ингибитора и уменьшенного расхода фермента на единицу поверхности электрода;

- рабочие условия измерения сигнала ацетилхолинэстеразных сенсоров на субстрат и ингибиторы в зависимости от способа модификации и фермент-ингибиторной специфичности, свидетельствующие об отсутствии мешающего влияния гетерогенного характера реакции на измеряемые параметры биосенсора.

- определение наномолярных количеств пестицидов (параоксон, малаоксон, малатион) с чувствительностью, зависящей от природы карбоксилированных заместителей и конфигурации тиакаликс[4]аренов, в модельных растворах, водах и фруктовых соках.

Апробация работы. Результаты проведенных исследований докладывали на Итоговой научной конференции Химического института им.А.М.Бутлерова Казанского (Приволжского) федерального университета (Казань, 2011), Конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Научно-образовательного центра «Материалы и технологии 21 века» при Казанском (Приволжском) федеральном университете (Казань, 2011), III Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа «ЭМА-2012» (Уфа – Абзаково, 2012), Симпозиуме НАТО «Portable chemical sensors for the rapid detection of chemical and biological agents and other weapons of terrorism» (Лунд - Сногхольм, Швеция, 2011).

Публикации. По результатам исследований опубликованы 2 статьи в международных реферируемых журналах, 1 глава в коллективной монографии и 3 тезисов доклада на конференциях различного уровня.

Личный вклад автора в работы, выполненные в соавторстве и включенные в диссертацию, состоял в постановке и решении основных задач, проведении основных экспериментальных исследований в области модификации электродов макроциклическими рецепторами и углеродными материалами, изучении их вольтамперных и импедиметрических характеристик, разработке методик определения субстрата и ингибиторов холинэстераз, оценке кинетических параметров ингибирования, интерпретации и систематизации полученных результатов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов, списка использованных библиографических источников (141 источник). Диссертация изложена на 127 страницах компьютерной верстки, содержит 22 рисунка и 16 таблиц.

Во Введении раскрыта актуальность темы исследования, определены цели и задачи, сформулированы научная новизна, практическая значимость и положения, выносимые на защиту.

В Литературном обзоре (глава 1) рассмотрены особенности функционирования холинэстеразных сенсоров для определения фосфорорганических пестицидов. В частности рассмотрены особенности взаимодействия холинэстеразы с необратимыми ингибиторами,

В Экспериментальной части (глава 2) представлены данные об объектах исследования, используемых методах и измерительном оборудовании, приведены условия формирования чувствительного слоя разработанных биосенсоров, условия измерения и способы обработки сигнала в отношении определяемых соединений.

Главы 3 и 4 посвящены обсуждению полученных результатов.

Диссертация выполнена на кафедре аналитической химии ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» при поддержке грантов РФФИ 09-03-92420_КЭ «Композиты на основе углеродных нанотрубок и электрохимически активных полимеров для создания новых биосенсоров» и 11-03-381а «Амплификация сигнала электрохимических (био)сенсоров путем самосборки полиэлектролитов с включением наноразмерных медиаторных систем», а также ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг. (мероприятие № 1.2.1 Проведение научных исследований научными группами под руководством докторов наук, госконтракт № 16.740.11.0496 от 16 мая 2011 г. «Электрохимические ДНК-сенсоры для детектирования белков и токсинов на основе наноразмерных медиаторных систем»).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Экспериментальная часть

Амперометрические холинэстеразные сенсоры изготавливали на основе стеклоуглеродных электродов (СУЭ) с площадью рабочей поверхности 2.5 мм2, модифицированных ФЦК и ОУН, ФЦК и УС, ФЦК и карбоксилированными тиакаликс[4]аренами (структурные формулы приведены в табл.1). Кроме того, ингибирование фермента изучали на печатных графитовых электродах, изготовленных методом трафаретной печати на полуавтоматическом принтере DEK 248 (DEK, Англия). В работе использовали АХЭ (КФ 3.1.1.7) из электрического органа угря («Sigma-Aldrich», Германия, 687 Е/мг белка). Ковалентную иммобилизацию фермента проводили путем карбодиимидного связывания с помощью N-(3-диметиламинопропил)-N-этилкарбодиимид хлорида и N-гидроксисукцин­имида. Субстратом ферментативной реакции служил ацетилтиохолин хлорид (АТХ). Продукт его гидролиза (тиохолин) регистрировали по току окисления при 50-200 мВ отн. Ag/AgCl.





В качестве модельных необратимых ингибиторов АХЭ использовали стандартные образцы фосфорорганических пестицидов Pestanal («Sigma-Aldrich», США). Степень ингибирования иммобилизованной АХЭ рассчитывали как относительное уменьшение тока окисления тиохолина, измеренного до и после инкубирования биосенсора в растворе ингибитора в течение 15 мин. Окисление тионовых пестицидов перед измерением проводили с использованием электрогенерированного хлора, получаемого в гальваностатическом электролизе в растворе пестицида, содержащем 0.1 М NaCl.

Электрохимические измерения проводили в трехэлектродной нетермостатированной ячейке в режиме постояннотоковой вольтамперометрии и хроноамперометрии с помощью потенциостата-гальваностата AUTOLAB PGSTAT 302N («Metrohm Autolab b.v.», Голландия). Электрохимический импеданс измеряли с помощью модуля FRA2 AUTOLAB PGSTAT 302N в присутствии эквимолярной смеси феррицианидов калия. Расчет сопротивления переноса заряда проводили по эквивалентной схеме Рэндлса.

Таблица 1. Список использованных в работе тиакаликс[4]аренов

Шифр Название тиакаликс[4]арена Структура
5,11,17,23-Тетра-трет-бутил-25,26, 27,28- тетракис-[(ди(гидроксикарбо­нилметил)иминокарбонил)-метокси]-2,8,14,20-тетратиакаликс[4]арен (конус)
5,11,17,23-Тетра-трет-бутил-25,26, 27,28-тетракис-[(ди(гидроксикарбо­нилметил)иминокарбонил)-метокси]-2,8,14,20-тетратиакаликс[4]арен (частичный конус)
5,11,17,23-Тетра-трет-бутил-25,26, 27,28-тетракис-[(ди(гидроксикарбо­нилметил)иминокарбонил)-метокси]-2,8,14,20-тетратиакаликс[4]арен (1,3-альтернат)
5,11,17,23-Тетра-трет-бутил-25,26, 27,28-тетра[(гидроксиацетамидоацет­амидокарбонил)метокси]-2,8,14,20-тетратиакаликс[4]арен (конус)

Продолжение табл.1

5,11,17,23-Тетра-трет-бутил-25,26, 27,28-тетра[(гидроксиацетамидо-ацетамидокарбонил)метокси]-2,8,14,20-тетратиака-ликс[4]арен (частичный конус)
5,11,17,23-Тетра-трет-бутил-25,26, 27,28-тетра[(гидроксиацетамидо-ацетамидокарбонил)метокси]-2,8,14,20-тетратиа-каликс[4]арен (1,3-альтернат)
3 5,11,17,23-Тетра-трет-бутил-25,26,27-тригидрокси-28-(2’-[2’’-(гидрокси­карбонил)этиленкарбониламино]этокси)-2,8,14,20-тетра-тиакаликс[4]арен
4 5,11,17,23-Тетра-трет-бутил-25,26,27-три(цианопропокси)-28-(2’-[2’’-(гидроксикарбонил)этиленкар­бониламино]этокси)-2,8,14,20-тетратиакаликс[4]арен (1,3-альтернат)
5 п-трет - Бутилтиакаликс[4]арен

ВЛИЯНИЕ МОДИФИКАТОРА НА ОПЕРАЦИОННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИХ ХОЛИНЭСТЕРАЗНЫХ СЕНСОРОВ

В качестве модификаторов электродов при создании ацетилхолинэстеразных сенсоров в работе были использованы материалы, улучшающие электрохимические характеристики сенсоров при определении продукта ферментативной реакции - тиохолина. К ним относятся ФЦК, ОУН и УС. Необходимость их использования обусловлена высоким перенапряжением окисления тиохолина, препятствующим применению сенсоров в присутствии электрохимически активных примесей, а также необходимостью увеличения удельной площади поверхности преобразователя сигнала для повышения эффективности иммобилизации АХЭ. Также в работе в качестве модификаторов поверхности сенсоров были использованы тиакаликс[4]арены, способные образовывать наноструктурированные покрытия. Их присутствие увеличивает эффективность ковалентной иммобилизации фермента при сохранении проницаемости слоя для низкомолекулярных носителей заряда. В структуре ОУН, УС и тиакаликс[4]аренов присутствуют карбоксильные группы, участвующие в карбодиимидной сшивке фермента.

Модифицированные электроды были изучены методом спектроскопии электрохимического импеданса (сопротивление переноса заряда R2 для электродов, модифицированных различными комбинациями углеродных наноматерилов, ФЦК и макроциклических рецепторов, приведено на рис.1).

1 – СУЭ; 2 – УС; 3 – ОУН; 4 – ФЦК (0.13 мкг/мм2); 5 – ФЦК 0.39 мкг/мм2; 6 – ОУН + 0.13 мкг/мм2 ФЦК; 7 - ОУН + 0.13 кг/мм2 ФЦК и тиакаликс[4]арен ; 8 - ОУН + 0.13 кг/мм2 ФЦК + тиакаликс[4]арен 5; 9 - УС + ФЦК 0.39 мкг/мм2 + тиакаликс [4]арен ; 10 - УС+ ФЦК 0.39 мкг/мм2 + тиакаликс[4]арен 5


Pages:   || 2 | 3 |
 

Похожие работы:










 
© 2013 www.dislib.ru - «Авторефераты диссертаций - бесплатно»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.