авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ РОССИЙСКАЯ БИБЛИОТЕКА - WWW.DISLIB.RU

АВТОРЕФЕРАТЫ, ДИССЕРТАЦИИ, МОНОГРАФИИ, НАУЧНЫЕ СТАТЬИ, КНИГИ

 
<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Групповое и индивидуальное иммунохимическое определение некоторых биологически значимых соединений с амперометрическим детектированием

-- [ Страница 1 ] --

Казанский Государственный университет

_____________________________________________________________________________

На правах рукописи

Варламова Регина Марковна

Групповое и индивидуальное иммунохимическое определение некоторых биологически значимых соединений с амперометрическим детектированием

02.00.02 – аналитическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

Казань –2007

Работа выполнена на кафедре аналитической химии Химического института им. А.М. Бутлерова государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования “Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова-Ленина” Министерства образования и науки Российской Федерации

Научный руководитель: доктор химических наук,

профессор Э.П. Медянцева

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

С.Ю. Гармонов

кандидат химических наук,

доц., М.П. Кутырева

Ведущая организация: Казанский государственный

технический университет им. А.Н. Туполева

Защита диссертации состоится «31» мая 2007 г. в 14.00 на заседании диссертационного Совета К 212.081.04 по химическим наукам Казанского государственного университета по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18, Химический институт им. А.М Бутлерова, Бутлеровская аудитория

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им.

Н.И. Лобачевского Казанского государственного университета

Отзывы на автореферат просим присылать по адресу: 420008, г. Казань,

ул. Кремлевская, 18, КГУ, Служба аттестации научных кадров

Автореферат разослан « » апреля 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета,

кандидат химических наук Шайдарова Л.Г.

Актуальность темы. Разработка простых, экспрессных и в то же время чувствительных и селективных способов определения широкого круга биологически активных соединений - задача, которая была, есть и будет актуальной еще долгое время.

Зачастую, на стадии предварительных испытаний, отсутствует необходимость определять конкретное соединение, что всегда сопряжено с дополнительными материальными и временными затратами, и можно ограничиться информацией о наличии соединений определенного класса, т.е. получить сигнал «есть-нет», например, относительно потенциальных загрязнителей в объекте анализа. Это может послужить основанием для оперативного принятия соответствующих природоохранных мер и лишь затем, при необходимости, выявить конкретный загрязнитель.

Концепция обобщенных показателей и группового анализа, характеризующих состояние анализируемых объектов, которые в ряде случаев предшествуют определению индивидуальных соединений, находит все больше сторонников среди исследователей. При гораздо меньших затратах групповой анализ позволяет получить результат, который можно использовать в практических целях и который, в целом, определяет общую стратегию дальнейшего исследования.

Один из путей решения этой проблемы – разработка новых способов анализа, новых тест-систем, которые в зависимости от принципа действия, используемых химических реагентов, состава, условий проведения определений и способа получения информации, могут позволить найти подходы к анализу объектов неизвестного состава, что по-прежнему составляет одну из сложнейших и нерешенных до конца задач аналитической химии.



Цель исследования: разработка подходов и методических приемов для создания комбинированного способа группового определения класса (нескольких) биологически активных веществ (пестициды, лекарственные препараты) и последующего определения индивидуальных соединений в сложных по составу объектах, путем иммуноэкстракции определяемых соединений с помощью иммобилизованных антител (сорбентов) с последующим определением амперометрическими биосенсорами.

Научная новизна. Предложен методический подход, основанный на иммуноэкстракции сначала группы соединений одного класса (групп-специфичный анализ), а затем иммуноэкстракции отдельных представителей этого класса соединений (индивидуальный анализ), осуществляемый за счет сочетания специфичности действия иммобилизованных сорбентов различной природы (антитела и полимеры с молекулярными

________________________________________________________________________________

Научным консультантом работы является академик РАЕН и МАНВШ, доктор химических наук, профессор Будников Г.К.

отпечатками) и амперометрических биосенсоров. Рассчитаны количественные характеристики иммуноэкстракции пестицидов и антидепрессантов разных классов с помощью иммобилизованных антител. Оценена возможность использования иммобилизованных полимеров с молекулярными отпечатками как альтернатива иммобилизованным антителам для определения гербицида 2,4–Д. Показана возможность концентрирования, исходя из максимальной сорбционной емкости иммобилизованных антител и полимеров с молекулярными отпечатками и величины отклика холинэстеразного биосенсора.

Для реализации предлагаемого способа определения антидепрессантов разработаны новые амперометрические биосенсоры на основе иммобилизованной моноаминоксидазы, печатных и стекоуглеродного электродов, в основу функционирования которых положены сочетание реакции окислительного дезаминирования биогенных аминов и электрохимического окисления продуктов их ферментативной реакции. Показана возможность оценки количественного содержания антидепрессантов разных классов по их ингибирующему действию на иммобилизованную моноаминоксидазу. Рассчитаны кинетические параметры реакции окислительного дезаминирования дофамина в отсутствие и в присутствии различных концентраций ингибиторов моноаминоксидазы.

Предложен алгоритм проведения иммуноэкстракционных определений биологически значимых веществ в образце неизвестного состава с помощью иммобилизованных антител разной специфичности действия и амперометрических биосенсоров.

Практическая значимость. Предложен комбинированный способ анализа, представляющий собой новое решение задачи селективного и высокочувствительного определения группы соединений и (или) отдельного соединения в сложной по составу смеси, в присутствии родственных по структуре и свойствам соединений, что невозможно с использованием других приемов и подходов. Разработана методика иммунохимического определения как группы триазиновых гербицидов, так и их отдельных представителей в продуктах питания, гербицида 2,4–дихлорфеноксиуксусной кислоты в молоке с использованием полимера с соответствующими молекулярными отпечатками.

Разработан вариант иммунохимического определения трициклических антидепрессантов с использованием иммобилизованных антител и амперометрических моноаминоксидазных биосенсоров. Проведена апробация разработанных биосенсоров при определении лекарственных соединений (пиразидола и флуоксетина) в фармпрепаратах и дезипрамина в сыворотке крови.

Показаны перспективы практической реализации предлагаемого комбинированного способа определения биологически активных веществ в виде тест-систем для группового и индивидуального иммуноэкстракционного определения пестицидов, лекарственных соединений с амперометрическим детектированием.

На защиту выносятся:

  • Результаты изучения сочетания иммуноэкстракции группы триазиновых гербицидов, нескольких антидепрессантов с помощью соответствующих иммобилизованных Ат разной специфичности действия, а также отдельных представителей определяемых классов соединений с последующим детектированием амперометрическими биосенсорами (холинэстеразным, моноаминооксидазным).
  • Количественные характеристики и аналитические возможности процессов иммуноэкстракции (сорбции, десорбции) и концентрирования с помощью иммобилизованных антител и полимеров с молекулярными отпечатками.
  • Модели амперометрических моноаминоксидазных биосенсоров на основе различных физических преобразователей – платиновых печатных и стеклоуглеродного электродов для определения антидепрессантов разных классов.
  • Кинетические параметры реакции окислительного дезаминирования дофамина в присутствии антидепрессантов.
  • Константы образования иммунных комплексов и оценка перекрестной реактивности используемых антител к антидепрессантам.
  • Методики определения группы триазиновых пестицидов (отдельных представителей гербицидов триазинового ряда), гербицида 2,4–Д в пищевых продуктах, антидепрессантов в лекарственных формах (пиразидол, флуоксетин) и в биологических жидкостях (дезипрамин).

Апробация работы: Материалы диссертации докладывались и обсуждались на Всероссийской конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика И.П. Алимарина “Аналитика России” (Москва, 2004), II Международном симпозиуме "Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии". (Краснодар 2005), Всероссийской научной конференции с международным участием “Электроаналитика-2005” (Екатеринбург, 2005 г.), Международной научной конференции “Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий” (Томск 2006), итоговой научной конференции Казанского государственного университета (2006), VI Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно–образовательного центра Казанского государственного университета “Материалы и технологии XXI века”, Российской школе – конференции молодых ученых “Экотоксикология: современные биоаналитические системы, методы и технологии” (Пущино 2006).

Работа проводилась при частичной финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, проект 03-03-33116.

Публикации: По теме диссертации публиковано 17 работ. Из них 5 статей и 12 тезисов докладов на всероссийских и международных конференциях. 2 статьи приняты к печати.

Структура и объем работы: Диссертация изложена на 151 страницах машинописного текста, содержит 25 таблиц и 14 рисунков. Работа состоит из введения, семи глав, выводов и списка литературы, включающего163 ссылок.

Первая глава литературного обзора посвящена современным методам определения триазиновых и хлорорганических пестицидов: твердофазной экстракции, иммунохимическому анализу, применению сенсорных устройств и полимеров с молекулярными отпечатками.

Во второй главе литературного обзора описаны современные методы анализа лекарственных соединений на примере антидепрессантов.

Третья глава содержит постановку задачи, методы и условия эксперимента.

Четвертая глава посвящена разработке принципов комбинированного способа анализа за счет сочетания иммуноэкстракции группы триазиновых гербицидов с помощью иммобилизованных Ат, их отдельных представителей с последующим детектированием амперометрическим холинэстеразным биосенсором.

В пятой главе представлены результаты использования иммобилизованных полимеров с молекулярными отпечатками для определения гербицида 2,4 – дихлорфеноксиуксусной кислоты, как альтернатива иммобилизованным антителам.

В шестой главе нашли отражение результаты, связанные с дальнейшим развитием представленных ранее (глава 4) подходов и приемов на примере иммуноэкстракционного определения антидепрессантов. Представлены результаты разработки новых амперометрических биосенсоров на основе иммобилизованной моноаминоксидазы и планарных или стеклоуглеродного электродов, их аналитические возможности. Описаны методики определения отдельных антидепрессантов в фармпрепаратах и биологических жидкостях.

Седьмая глава посвящена перспективам практической реализации предлагаемого комбинированного способа определения биологически активных веществ в виде тест-систем.

Экспериментальная часть

В качестве объектов исследования использовали хроматографически чистые: симазин, атразин, пропазин, 2,4 – Д, дезипрамин, имипрамин, нортриптилин, флуоксетин, пиразидол, соответствующие антитела к ним (предоставлены проф. С.А.Ереминым, каф. химической энзимологии МГУ) и полимеры с молекулярными отпечатками (ПМО) на 2,4-Д (предоставлены проф. С.Г.Дмитриенко, каф. аналитической химии МГУ). Применяли бутирилхолинэстеразу (БуХЭ) сыворотки крови лошади, активностью 30АЕ/мг и моноаминоксидазу из мозга человека с активностью 0.075 мкм/минмг (предоставлена доц. А.Н.Фаттаховой, каф. биохимии КГУ). В качестве субстратов использовали бутирилтиохолин иодид (БТХИ) и 0.5% раствор дофамина. Для иммобилизации моноаминоксидазы в качестве матрицы использовали пищевой желатин марки П – 11. Применяли промышленно изготовленные нитрат целлюлозные (НЦ) мембранные фильтры фирмы “Сарториус”, Германия. Для иммобилизации ПМО использовали нитрат целлюлозу типа колоксилин. Применяли 12.5%-ный раствор глутарового альдегида (ГА) и сывороточный альбумин человека (ЧСА).





Основой холинэстеразных и моноаминоксидазных биосенсоров служила система, состоящая из платинового, вспомогательного электродов и электрода сравнения, полученная на керамической подложке методом печатных технологий (фирма BVT Technologies, Брно, Чехия). Объем рабочей ячейки системы составлял 200 мкл. Измерения проводили с помощью многоцелевого электрохимического детектора "МЕВ" с компьютеризированным управлением.

Отдельные контрольные опыты проводили с использованием стационарных платинового, ртутно-пленочного, стеклоуглеродного электродов на осциллографическом полярографе ПО-5122 модели 03 и вольтамперометрическом анализаторе “Экотест-ВА” (Россия).

Возможности группового и индивидуального иммуноэкстракционного определения триазиновых гербицидов с амперометрическим детектированием

Для оценки возможности проведения группового анализа триазиновых пестицидов были использованы модельные растворы, в состав которых входили симазин и атразин при различных соотношениях (1:1 в различных диапазонах концентраций, 1:10, 10:1) с использованием холинэстеразных биосенсоров на основе планарных платиновых электродов. В основе формирования аналитического сигнала ХЭ биосенсора лежит сочетание реакции ферментативного гидролиза БТХИ и электрохимической реакции окисления продукта гидролиза субстрата, что регистрируется при потенциале +0.55 В.

Уменьшение величины аналитического сигнала в присутствии изучаемых гербицидов указывает на ингибирующее действие их на ИХЭ, входящую в состав биочувствительной части амперометрического биосенсора на основе печатных электродов, что наблюдается в определенном диапазоне концентраций (табл. 1).

Полученные результаты показывают, что возможно определение как отдельных представителей гербицидов триазинового ряда, так и нескольких представителей группы.

Повысить селективность определений можно, используя процессы иммуноэкстракции определяемых соединений с помощью иммобилизованных антител (ИАт), с последующей регистрацией степени протекания биоспецифических взаимодействий с помощью холинэстеразного биосенсора. В основу такого определения положены стадии образования и последующего разрушения иммунного комплекса Ат-пестицид.

Таблица 1

Аналитические возможности определения триазиновых гербицидов холинэстеразными биосенсорами на основе планарных платиновых электродов

Гербициды (соотношения концентраций) Область рабочих концентраций, моль/л Уравнение градуировочной зависимости Ip = А + B lg C и коэффициент корреляции r % ингиби рования
А± (В±)(-lg C) R
Симазин 110-7 – 510-12 (107±3.5) (-9.1±0.4)(-lg C) 0.9947 32.4±0.6
Атразин 110-6 - 110-10 (33.8±0.9) (-2.6±0.1)(-lg C) 0.9984 25±1
(симазин: атразин) 1:1 110-6 - 110-11 (46.6±1.9) (-4.0±0.2)(-lg C) 0.9939 30.0±0.6
(симазин: атразин) 1:10 110-6 - 110-10 (55.5±0.9) (-4.9±0.1)(-lg C) 0.9992 25.4±0.8
(симазин: атразин) 10:1 110-6 - 110-11 (79.1±2.8) (-6.7±0.3)(-lg C) 0.9953 35±1

Оценены некоторые параметры, характеризующие физико-химические свойства иммуносорбента, от которых зависит эффективность экстракции (а также, в наших условиях, и концентрирования).

Установлено, что в диапазоне рН от 7 до 8,6 наблюдается практически полное извлечение триазиновых гербицидов из анализируемого раствора даже при однократной иммуноэкстракции (рис.1). Образование иммунного комплекса лучше всего проводить в нейтральной среде при комнатной температуре.

На степень извлечения влияет время инкубации ИАт в исследуемом растворе. Для образования иммунного комплекса пестицид - ИАт необходимо не менее 5 минут (рис.2), как в случае определения смеси пестицидов, так и их индивидуальных представителей.

Сорбционную емкость (СЕ) НЦ мембраны оценивали, анализируя содержание гербицидов сорбированных ИАт и в равновесном растворе после иммуноэкстракции в оптимальных условиях, меняя количество введенного соединения (рис.3).

Характеристики процесса иммуноэкстракции приведены в таблице 2.

На практически полное извлечение симазина и атразина в выбранных условиях

Рис.1. Зависимость степени извлечения смеси гербицидов (1:1) (1) и симазина (2) от рН раствора, Сгербицидов = 110-7 М. Рис. 2. Зависимость степени извлечения смеси гербицидов (1:1) (1), атразина (2) от времени образования иммунного комплекса, Сгербицидов= 110-7 М.


Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 

Похожие работы:










 
© 2013 www.dislib.ru - «Авторефераты диссертаций - бесплатно»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.