авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ РОССИЙСКАЯ БИБЛИОТЕКА - WWW.DISLIB.RU

АВТОРЕФЕРАТЫ, ДИССЕРТАЦИИ, МОНОГРАФИИ, НАУЧНЫЕ СТАТЬИ, КНИГИ

 
<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 7 |

Молекулярные аспекты функционирования рибосомных рнк

-- [ Страница 1 ] --

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи

СЕРГИЕВ Петр Владимирович

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ АСПЕКТЫ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ РИБОСОМНЫХ РНК

02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора химических наук

Москва - 2008 г.

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

профессор, чл-корр. РАН Цетлин В.И.

доктор химических наук,

профессор Лаврик О.И.

доктор биологических наук,

профессор Гарбер М. Б.

Ведущая организация: Институт Молекулярной Биологии

им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится 26 февраля 2008 г. в 16 часов на заседании совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Воробьевы горы, МГУ, лабораторный корпус “А”, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 21 января 2008 г.

Ученый секретарь совета,

кандидат химических наук Смирнова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Рибосома это молекулярное устройство, осуществляющее синтез белков из аминокислот, приносимых транспортной РНК (тРНК), согласно инструкциям, закодированным в последовательности нуклеотидов матричной РНК (мРНК). Рибосома состоит из большой (50S) и малой (30S) субчастиц и имеет три участка связывания тРНК – А, Р и Е. В ходе своей работы она взаимодействует с несколькими десятками различных лигандов и координирует работу своих функциональных центров, разнесенных в пространстве. Основную структурную и функциональную роль в рибосоме выполняет рибосомная РНК (рРНК). Основу 30S субчастицы составляет 16S рРНК, основу 50S субчастицы – 23S и 5S рРНК. Малая субчастица образует декодирующий центр, в котором происходит проверка соответствия (комплементарности) кодона мРНК и антикодона аминоацил-тРНК (аа-тРНК). Связывание аа-тРНК осуществляется при помощи комплекса фактора элонгации Tu и GTP (аа-тРНК*EF-Tu*GTP). После гидролиза GTP, который происходит в случае соответствия кодона мРНК и антикодона тРНК, аа-тРНК перемещается в А участок. При этом 3’-конец аа-тРНК, несущей аминокислоту проникает в пептидилтрансферазный центр (peptidyltransferase center, PTC) большой субчастицы рибосомы. В этом каталитическом центре происходит перенос синтезируемого рибосомой пептида с 3’-конца тРНК, связанной с Р участком рибосомы, на аминокислоту, связанную с тРНК, находящейся в А участке. После переноса пептида возникает необходимость переместить молекулы тРНК из А и Р участков в Р и Е участки, чтобы освободить А участок для связывания следующей аа-тРНК. Вместе с тем, необходимо переместить мРНК на три нуклеотида, чтобы можно было считать следующий кодон. Согласно гипотезе, сформулированной Спириным и Бретшером, а затем подтвержденной Моазедом и Ноллером, перемещение тРНК (транслокация) происходит сначала на большой субчастице, а затем на малой. Транслокация катализируется фактором элонгации G (EF-G) в комплексе с GTP, который в ходе транслокации гидролизуется.



В начале 21 века изучение рибосомы вышло на качественно новый уровень. С помощью рентгеноструктурного анализа были определены с высоким разрешением структуры рибосомных субчастиц, а затем и всей рибосомы. Появилась возможность формулировать вопросы и предположения о назначении тех или иных “деталей” рибосомы и подвергать их экспериментальной поверке. Методы изучения структуры рибосомы – рентгеноструктурный анализ и криоэлектронная микроскопия помогли выявить несколько изменений структуры рибосомы в ходе биосинтеза белка. Однако, функциональная роль этих изменений не может быть установлена исключительно с помощью определения строения рибосом. Направленное изменение тех или иных элементов пространственной структуры с помощью мутаций и анализ мутантных рибосом позволяет понять роль этих элементов в процессе трансляции. В настоящее время изучение взаимосвязи структуры и функции рибосомы - это чрезвычайно динамично развивающаяся область биоорганической химии и молекулярной биологии. Более того, без понимания механизмов работы таких молекулярных устройств, как рибосома, невозможно представить себе дальнейший прогресс в создании искусственных молекулярных машин нанометровых размеров.

Цель работы. Понять роль ряда элементов рибосомной РНК в функционировании рибосомы.

Задачи:

1. Найти неизвестные ранее гены ферментов, проводящих модификацию рРНК, и определить роль модификаций рРНК в клетке.

2. Определить функциональную роль элементов 16S рРНК, участвующих в формировании структуры декодирующего центра.

3. Установить функциональную роль формы желоба 50S субчастицы, по которому аа-тРНК поступает в А участок.

4. Выяснить функциональную роль Е и Р/Е участков связывания тРНК в рибосоме.

5. Установить, какие элементы 23S рРНК обеспечивают аллостерическую связь Р/Е участка и участка связывания факторов элонгации. Определить, как происходит выбор между связыванием EF-G и EF-Tu при их конкуренции за общий участок связывания с рибосомой.

Научная новизна и практическая значимость. Все результаты работы получены впервые и не описаны ранее в научной литературе. В ходе выполнения работы впервые определены гены рРНК метилтрансфераз, модифицирующих основания G966 16S рРНК, A1618, G1835 и G2445 23S рРНК E. coli. Показано, что субстратом для метилтрансферазы YhhF, метилирующей NH2 группу нуклеотида G966 16S рРНК, служит 30S субчастица. На основе пространственных структур 30S субчастицы и белка YhhF построена модель их комплекса. Предположено, что метилтрансфераза связывается с малой субчастицей в том месте, где в ходе функционального цикла рибосомы расположена антикодоновая петля тРНК, находящейся в Р участке. Субстратом метилтрансфераз YgjO и YcbY, модифицирующих нуклеотиды G1835 и G2445 23S рРНК, служит, как было показано, депротеинизированная рРНК. Метилированные нуклеотиды m2G1835 и m2G2445 23S рРНК расположены в области контакта субчастиц и в пептидилтрансферазном центре. Метилтрансфераза YbiN проводит монометилирование нуклеотида А1618 23S рРНК. Субстратом для нее служит промежуточный комплекс сборки 50S субчастицы, сходный с рибонуклеопротеидом, образующимся при частичной депротеинизации 50S субчастицы. Хотя отсутствие любой из обнаруженных в работе метилтрансфераз приводит к замедлению роста клеток, оно не нарушает работу рибосомы in vivo.

В работе разработана методология изучения функции рибосомной РНК с помощью мутагенеза. Впервые в мире разработан метод выделения рибосом, несущих аптамер в рРНК, с помощью аффинной хроматографии. В результате стало возможным выделять и изучать рибосомы, несущие летальные мутации. Собраны в одну систему методы изучения структуры рРНК и способы определения эффективности отдельных стадий трансляции.

Впервые получены мутации нуклеотидов 16S рРНК, участвующих в третичных взаимодействиях спирали 34 16S рРНК. Обнаружено, что мутации влияют на точность трансляции и предложено объяснение этого эффекта. Впервые доказано экспериментально, что нуклеотидные остатки U2492, C2556 и C2573 23S рРНК, образующие сужение на пути перемещения аа-тРНК в А участок не важны для скорости этого перемещения.

Детально изучен механизм аллостерической связи между Р/Е участком и участком связывания факторов элонгации. Впервые показано, что не отсутствие пептидной группы на тРНК, находящейся в Р участке, а способность этой тРНК перемещаться в Р/Е участок способствует связыванию EF-G и многократному не сопряженному с транслокацией гидролизу GTP.

С помощью мутаций проверена возможность передачи аллостерического сигнала через спирали 38, 39, 89, 91, 95 (SRL) и 42 23S рРНК. Показано, что спираль 38 и петли спиралей 89 и 91 не участвуют в передаче сигнала. Мутации в спирали 39 способствовали стабилизации такой конформации 23S рРНК в составе рибосомы, при которой защищены от химической модификации нуклеотиды 23S рРНК, взаимодействующие с тРНК, связанной с Р участком. С помощью мутации в спирали 95 23S рРНК (SRL) было обнаружено, что гидролиз GTP не требует прочного взаимодействия EF-G с SRL. В тоже время, это взаимодействие необходимо для транслокации. Полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что гидролиз GTP элонгационным фактором G предшествует транслокации. Движение спиралей 43-44 23S рРНК (GAC), наблюдаемое при связывании с рибосомой факторов элонгации, было вызвано нами искусственно, вне зависимости от присутствия лигандов рибосомы, с помощью мутации в спирали 42 23S рРНК. Впервые показано, что движение GAC в сторону SRL не мешает связыванию аа-тРНК*EF-Tu*GTP с рибосомой и декодированию, но препятствует связыванию EF-G*GTP и транслокации. С помощью химической модификации выявлена сеть третичных взаимодействий, связывающая пептидилтрансферазный центр с центром связывания факторов элонгации. Предложена модель селективного связывания факторов элонгации с рибосомой в зависимости от того, какое положение занимает в ней GAC.

Результаты работы опубликованы в виде 10 статей в отечественных и 23 статей в зарубежных научных журналах, а также глав в 3 книгах и 2 методических разработках.

Уникальные методы, разработанные в работе, такие, как метод детекции протонированных оснований в рРНК и метод аффинной хроматографии рибосом могут быть использованы в институтах, занимающихся исследованиями в области биоорганической химии и молекулярной биологии как в нашей стране, так и за рубежом. Разработанная нами система выделения рибосом с помощью аффинной хроматографии уже была успешно использована в Университете Брауна, США. Результаты, полученные в ходе выполнения работы, отвечают на многие вопросы о механизме функционирования сложных молекулярных машин и имеют фундаментальную научную ценность. Кроме того, выявленные в работе участки рРНК, необходимые для функционирования рибосомы, могут быть использованы как мишени для разработки новых видов антибиотиков.

Работа была поддержана грантами: РФФИ, HHMI, Fogarty, CRDF.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на нескольких десятках международных конференций, в том числе на ключевых международных конференциях по функции РНК и трансляции:

-The Ribosome: Structure, Function, Antibiotics, and Cellular Interactions, June 13-17, 1999, Helsingor, Denmark

- RNA2001, 6th Annual meeting of the RNA society, May 29 –June 3, 2001, Banff, Canada

-Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, The Ribosome, May 31- June 5, 2001, Cold Spring Harbor, USA

- The 5th International Engelhardt Conference on Molecular Biology, 21-26 июнь, 2001, Москва-Ярославль-Москва, Россия

-International conference in honour of Alexander Spirin, Protein synthesis, 27 августа – 1 сентября, 2001, Пущино, Россия

-The Dynamics of Ribosome Structure and Function, January 27 – February 1, 2002, Queenstown, New Zealand

- RNA2003, 8th Annual meeting of the RNA society, July 1–6, 2003, Vienna, Austria

- RNA2006, 11th Annual meeting of the RNA society, June 20-25, 2006, Seattle, USA

- The 8th International Engelhardt Conference on Molecular Biology "RNA – Protein Interactions", 19-24 августа, 2006, Московская обл., Россия

-Ribosomes: Form and Function, June 3-8, 2007, North. Falmouth, USA

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 286 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и их обсуждение, материалы и методы, выводы. Материал иллюстрирован 85 рисунками и 10 таблицами. Библиографический указатель включает 405 цитированных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В настоящее время определена структура комплексов рибосомы, находящейся на различных этапах ее функционального цикла, однако функциональная роль конформационных изменений рРНК в этих комплексах не очевидна. Целью работы было изучение функциональной роли потенциально важных элементов рРНК и их наблюдаемых или предполагаемых конформационных изменений в ходе работы рибосомы. Стратегия, выбранная нами для изучения рибосомы это сочетание направленного мутагенеза компонентов рибосомы и анализа функциональных последствий внесенных мутаций.

Поиск генов рРНК-метилтрансфераз, ответственных за метилирование нуклеотидов G966 16S рРНК, A1618, G1835 и G2445 23S рРНК





Рибосомные РНК E. coli содержат 36 модифицированных нуклеотидов. Модификацию этих остатков проводят 32 фермента, из которых 10 до сих пор неизвестны. Распределение модифицированных нуклеотидов в пространственной структуре рибосомы крайне неравномерно. Большинство из них находятся в функциональных центрах рибосомы - декодирующем, пептидилтрансферазном и в местах контакта субчастиц. Отдельная группа модифицированных оснований сближена с туннелем, проходящим через большую субчастицу. Распределение модифицированных нуклеотидов в пространственной структуре рибосомы еще более неравномерно относительно участков связывания лигандов. Большинство модифицированных нуклеотидов сближены с тРНК, находящимися в А и Р участках. Особенно богато минорными остатками окружение Р участка. Понять функциональную роль модификаций рРНК можно, только получив клетки и рибосомы, в которых та или иная модификация не происходит. Для этого необходимо определить гены, ответственные за модификацию нуклеотидов и инактивировать их.

В нуклеотидной последовательности генома E. coli нами был произведен поиск открытых рамок считывания, кодирующих белки, гомологичные известным РНК метилтрансферазам. Штаммы, в которых соответствующие участки ДНК были заменены на ген устойчивости к канамицину, были любезно предоставлены нам проф. Х. Мори (Япония). Из штаммов, в которых предполагаемые рРНК-метилтрансферазы были инактивированы, была выделена суммарная клеточная РНК, большинство из которой составляла рРНК. Для того, чтобы понять, привела ли инактивация генов к отсутствию той или иной модификации, мы использовали метод обратной транскрипции.

Нуклеотид m2G966 16S рРНК напрямую взаимодействует с нуклеотидом 34 антикодоновой петли тРНК (Рис. 1а). Метилтрансфераза, проводящая модификацию этого нуклеотида была неизвестна. Обратная транскрипция рРНК, выделенной из клеток дикого типа, останавливалась за один нуклеотид до m2G966 (Рис. 1б, дорожка 1). Остановка обратной транскрипции не происходила, если использовалась рРНК, выделенная из клеток, в геноме которых ген yhhF был заменен на ген устойчивости к канамицину (Рис. 1б, дорожка 2). При инактивации генов других рРНК метилтрансфераз (Рис. 1б, дорожки 3, 4) остановка обратной транскрипции за один нуклеотид до G966 по-прежнему наблюдалась. Необходимо было доказать, что именно инактивация гена yhhF, а не изменение его окружения в геноме, послужила причиной отсутствия модификации. Мы трансформировали штамм, в котором ген yhhF на хромосоме был заменен на ген устойчивости к канамицину, плазмидой, в которой был закодирован ген yhhF. Экспрессия гена yhhF, содержавшегося на плазмиде, компенсировала отсутствие гена yhhF в геноме (Рис. 1б, дорожка 5). Для того, чтобы показать, что белок YhhF без каких-либо дополнительных белков способен модифицировать G966, мы провели метилирование in vitro. Для этого нами были выделены 30S рибосомные субчастицы и 16S рРНК из штамма, в котором ген yhhF был инактивирован. Также, с помощью металлохелатной хроматографии на Ni-NTA агарозе был выделен рекомбинантный белок YhhF, содержащий гексагистидиновый “довесок”. Рекомбинантный YhhF метилировал G966 в составе 30S субчастиц (Рис. 1б, дорожка 6), но не был способен метилировать 16S рРНК (Рис. 1б, дорожка 8). Модификации не наблюдалось в отсутствии S-аденозил-L-метионина (SAM) (Рис. 1б, дорожки 7, 9), что позволяет отбросить маловероятную возможность того, что yhhF кодирует не метилтрансферазу, а специфическую рибонуклеазу.

 Метилирование нуклеотида G966 16S-0

Рисунок 1. Метилирование нуклеотида G966 16S рРНК и влияние этого метилирования на жизнеспособность E. coli. А. Расположение m2G966 в пространственной структуре малой субчастицы. Красная лента – тРНК, оранжевая мРНК. Зеленым показан нуклеотид m2G966 (на него указывает стрелка), синим –m5C967, фиолетовым –m2G1207 16S рРНК. Б. Модификация нуклеотида G966 16S рРНК с помощью обратной транскрипции. A, C, G, U -дорожки определения нуклеотидной последовательности. Цифры соответствуют 16S рРНК: (1) дикого типа; (2) штамма, в котором yhhF инактивирован; (3) штамма, в котором ygjO инактивирован; (4) штамма, в котором ycbY инактивирован; (5) штамма, в котором yhhF кодируется только плазмидой; (6) выделенной из 30S субчастиц обработанных YhhF и SAM in vitro.; (7) выделенной из 30S субчастиц обработанных YhhF in vitro; (8) обработанной белком YhhF и SAM in vitro; (9) обработанной YhhF in vitro; Нуклеотиды 16S рРНК подписаны слева. Использовали олигодезоксирибонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 995-1011 16S рРНК. В. Скорость вытеснения клеток штамма без yhhF, клетками дикого типа. По оси ординат - доля клеток без yhhF. По оси абсцисс - количество циклов разведения культуры. Один цикл разведения соответствует примерно 10 удвоениям клеток.

 Пространственная структура YhhF-1

Рисунок 2. Пространственная структура YhhF (А) и модель структуры комплекса YhhF с рибосомой (Б).

Для оценки влияния модификации G966 на конкурентоспособность клеток, мы оценили эффективность вытеснения мутантного штамма из культуры клеток при совместной культивации с клетками дикого типа. Использовались различные среды и температуры культивации. Оказалось, что образование m2G966 дает клеткам небольшое преимущество при росте на богатой среде (Рис. 1в). Поскольку фенотип клеток, лишенных метилирования G966 был практически неотличим от дикого типа, мы сделали вывод о том, что маловероятна важная роль метильной группы, присоединенной к G966, в базовых стадиях трансляции. Возможно, метилирование G966 важно для регуляции работы рибосомы в каких-либо специфических, например, стрессовых условиях.

В нашей совместной работе с лабораторией проф. А. Йохимяка из Центра Структурной Геномики, США, была определена структура белка YhhF (Рис. 2а). Этот небольшой однодоменный белок имел пространственную укладку Россмана, сходную со структурами многих других метилтрансфераз. Интересно было сопоставить структуру этого фермента со структурой его субстрата, 30S субчастицы (Рис. 2б). Нуклеотидный остаток m2G966 расположен в углублении, образующем часть Р участка. В комплексе рибосомы с тРНК, m2G966 контактирует с наиболее далеко выступающим нуклеотидом антикодоновой петли тРНК и расположен практически в самом “глубоком” месте “щели”, в которой происходит связывание мРНК и антикодонов тРНК. Удивительно, как метилтрансфераза может контактировать со столь малодоступным нуклеотидным остатком. Возможно, именно этим обстоятельством объясняются малые размеры YhhF. Белок не содержит характерных для других ДНК и РНК метилтрансфераз дополнительных узнающих доменов. Напротив, сама форма YhhF способствует его связыванию с Р участком рибосомы, как это было показано при помощи созданной нами компьютерной модели (Рис. 2б). В отличие от большинства ферментов, в которых субстрат связывается во “впадине” активного центра белка, здесь фермент связывается в “активном центре” субстрата.



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 7 |
 

Похожие работы:







 
© 2013 www.dislib.ru - «Авторефераты диссертаций - бесплатно»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.