авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ РОССИЙСКАЯ БИБЛИОТЕКА - WWW.DISLIB.RU

АВТОРЕФЕРАТЫ, ДИССЕРТАЦИИ, МОНОГРАФИИ, НАУЧНЫЕ СТАТЬИ, КНИГИ

 
<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Функциональные полимерные системы для высокочувствительного анализа белков

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи




РОБЕР Марина Юрьевна

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ПОЛИМЕРНЫЕ СИСТЕМЫ ДЛЯ

ВЫСОКОЧУВСТВИТЕЛЬНОГО АНАЛИЗА БЕЛКОВ

Специальность 02.00.06 – Высокомолекулярные соединения

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

2009

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте высокомолекулярных соединений РАН.

Научный руководитель: доктор химических наук

Т. Б. Тенникова

Официальные оппоненты: доктор химических наук

А. Ю. Меньшикова

доктор химических наук, профессор

Л. А. Карцова

Ведущая организация: Санкт-Петербургский политехнический университет

Защита диссертации состоится «18» июня 2009 года в 10 час. на заседании диссертационного совета Д 002.229.01 при Учреждении Российской академии наук Институте высокомолекулярных соединений по адресу: 199004, г. Санкт-Петербург, Большой пр. В. О. д. 31, конференц-зал.


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской Академии Наук Института высокомолекулярных соединений РАН.

Автореферат разослан «15» мая 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 002.229.01 Н. А. Долотова

кандидат физ.-мат. наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Создание новых высокочувствительных методов анализа белков имеет огромное значение для современной медицины и биологии, поскольку диагностика многих патологических состояний основана на детектировании маркерных белков в сложных биологических жидкостях. Развитие биотехнологии также требует разработки быстрых и чувствительных методов анализа белковых молекул, ответственных за протекание биотехнологических процессов (рекомбинантная технология, тканевая инженерия).

Макропористые носители на основе синтетических полимеров на протяжении последних десятилетий успешно используются в проведении широкого ряда динамических сепарационных и биоконверсионных процессов. Применение носителей данного типа для создания биораспознающих систем в формате биочипов, предназначенных для комплексного аналитического скрининга сложных биологических объектов, позволяет повысить чувствительность и сократить время выполнения анализа. При этом эффективность анализа существенно зависит от свойств используемой твердой матрицы. Так, присутствие на поверхности носителя тех или иных функциональных групп определяет способ иммобилизации адсорбционно-активного лиганда, а реакционная способность и количество этих групп – биоспецифическую адсорбционную емкость твердой фазы. Морфологические особенности используемой матрицы также играют важную роль в обеспечении высокой адсорбционной емкости и возможности создания для молекулы белка условий, максимально близких к ее существованию в растворе. Таким образом, развитие биологических микрочипов тесно связано с внедрением новых типов носителей, обладающих улучшенными физическими и химическими характеристиками, которые позволили бы повысить их биоаналитическую эффективность.



Сополимер глицидилметакрилата (ГМА) и этиленгликольдиметакрилата (ЭДМА) является наиболее известным и широко используемым представителем макропористых сорбентов. Наличие в химической структуре сополимера эпоксидных групп позволяет проводить одностадийное ковалентное связывание молекул белка с поверхностью данного сорбента. Тем не менее, существенным недостатком ГМА-ЭДМА сорбентов является длительность процесса иммобилизации белка с участием оксирановых циклов, а также недостаточно высокая аффинная емкость носителя. В связи с этим, создание общего алгоритма конструирования трехмерных платформ для биочипов различного назначения и разработка носителей монолитного типа на основе сополимеров, содержащих функциональные группы, обеспечивающие быстрое связывание лиганда с поверхностью, представляется актуальной задачей.

Цель исследования. Целью настоящей работы являлась разработка принципов создания полимерных микроаналитических платформ, включающих полимерные слои монолитного типа, содержащие реакционно-способные функциональные группы и обладающие поровыми характеристиками, удовлетворяющими условиям проведения анализа в статических условиях, а именно, обеспечивающими свободное и достаточно быстрое проникновение макромолекул белка (или более крупных объектов, например, вирусов) внутрь порового пространства, а также высокую адсорбционную емкость носителя.

В связи с этим, были поставлены и решались следующие задачи:

  • поиск мономеров, содержащих функциональные группы, способные к быстрому взаимодействию с аминогруппой молекулы белка;
  • оценка способности выбранных мономеров к сополимеризации с дивинильным соединением с образованием монолитного макропористого материала и анализ полученных жестко сшитых сополимеров;
  • оптимизация условий синтеза сополимеров для получения материала с заданным размером пор;
  • исследование на примере модельного белка закономерностей иммобилизации лигандов на поверхности полученных носителей;
  • оптимизация технологии изготовления микроаналитических устройств на основе стеклянной поддерживающей среды и синтезированных полимерных слоев;
  • выбор оптимальных условий проведения микроанализа с использованием модельной аффинной пары белков;
  • оценка эффективности разработанных микроаналитических устройств на примере решения реальных биомедицинских и биотехнологических задач.

Объектами представленного исследования являлись синтетические сополимеры на основе метакрилатных и акрилатных мономеров, несущие на своей поверхности функциональные группы, способные взаимодействовать с аминогруппой молекулы белка.

При выполнении работы были использованы следующие методы исследования:

  • свободно-радикальная фотоинициируемая полимеризация для синтеза сополимеров;
  • элементный анализ и ИК-спектроскопия для характеристики полученных сополимеров;
  • интрузионная ртутная порометрия для определения среднего размера пор полимерных носителей и распределения их по размерам;
  • сканирующая электронная микроскопия для качественной оценки поровой структуры полученных материалов;
  • тонкослойная хроматография (ТСХ), обращено-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ОФ ВЭЖХ), спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР), масс-спектрометрия и спектроскопии в видимой области поглощения для исследования закономерностей иммобилизации модельного белка на поверхности полученных полимерных носителей;
  • люминесцентная микроскопия для осуществления микроанализа на поверхности разработанных полимерно-неорганических платформ с целью оценки эффективности их практического использования.

Научная новизна работы. Впервые осуществлен синтез двух макропористых материалов на основе сополимеров N–гидроксифталимидного эфира акриловой кислоты, глицидилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата и 2-цианоэтилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата. Разработан принцип конструирования полимер-содержащих платформ, составляющих функциональную основу биочипа, включающий изготовление на поверхности стекла операционных ячеек, силанизацию полученных ячеек и осуществление фотоинициируемой полимеризации непосредственно в изготовленных ячейках. Впервые показана возможность высокочувствительного детектирования белка в формате биочипов с использованием макропористых монолитных полимерных носителей.

Практическая значимость работы. Разработаны методы синтеза макропористых полимерных материалов монолитного типа, обладающих функциональными группами и воспроизводимой поровой структурой, пригодной для использования в конструкции биочипа, предназначенного для биологического микроанализа. Разработаны и апробированы методы определения пикомолярных количеств маркерного белка остеопонтина в клеточном супернатанте при тканево-инженерном производстве костной ткани, а также антител против антигена T. Pallidum в сыворотке крови человека.

Основные положения, выносимые на защиту:

  • Синтезированные материалы на основе сшитых жесткоцепных сополимеров N-гидроксифталимидного эфира акриловой кислоты, глицидилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата и 2-цианоэтилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата содержат функциональные группы, позволяющие осуществлять быструю модификацию их поверхности белком;
  • Поровая структура полученных материалов удовлетворяет требованиям проведения биоанализа в статических условиях, а именно, обеспечивает проникновение молекул белка внутрь порового пространства и высокую адсорбционную носителя;
  • Макропористые носители на основе синтезированных полимеров являются перспективными материалами для осуществления анализа белка в микроформате.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены в виде устных и стендовых сообщений на следующих российских и международных конференциях и симпозиумах: Санкт-Петербургская конференция молодых ученых “Современные проблемы науки о полимерах” (Санкт-Петербург, Россия, 2005, 2007, 2008); International Symposium “Molecular Mobility and Order in Polymer Systems” (Санкт-Петербург, Россия, 2005, 2008); Monolith Summer School (Порторож, Словения, 2006, 2008); International Congress on Analytical Sciences (ICAS-2006). (Москва, Россия, 2006); The Young Scientists’ and Students’ International Scientific Conference “Modern Problems of Microbiology and Biotechnology” (Одесса, Украина, 2007); European Congress and Exhibition on Advanced Materials and Processes (Euromat 2007) (Нюрнберг, Германия, 2007); Baltic Polymer Symposium 2007 (Друскининкай, Литва) и 2008 (Отепа, Эстония). Результаты работы также обсуждались на научно-практическом семинаре в Институте технической химии Университета Ганновера (Ганновер, Германия, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано восемнадцать печатных работ, включая две статьи в Журнале прикладной химии и Journal of Applied Polymer Science, две статьи в трудах международных конференций «3rd International and 28th European Peptide Symposium» и «Измерительные и информационные технологии в охране здоровья. Метромед 2007», а также 14 тезисов устных и стендовых докладов.

Вклад автора состоял в осуществлении всех представленных в работе экспериментов, активном участии в интерпретации полученных результатов, подготовке публикаций и докладов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Экспериментальной части, Обсуждения результатов, Выводов и Списка использованной литературы. Материалы диссертации изложены на 148 страницах, проиллюстрированы 12 таблицами и 49 рисунками, список цитируемой литературы включает 135 источников.

Данная работа выполнялась в соответствии с планом НИР ИВС РАН по теме «Создание материалов биомедицинского назначения на основе синтетических и природных полимеров», а также в рамках научной кооперации между Институтом высокомолекулярных соединений РАН и Институтом технической химии Университета Ганновера (Германия) (грант DFG KA 1784/4-1 и стипендия Немецкого Академического Общества по международному обмену DAAD 325 А/06/70831), при участии Военно- медицинской академии им. С. М. Кирова и технической поддержке фирмы BIA Separations GmbH (Любляна, Словения).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во Введении обоснована актуальность работы, обозначена научная новизна и практическая значимость, сформулированы цели и задачи исследования.

Глава 1. Обзор литературы состоит из трех разделов. В первом разделе рассмотрены особенности синтеза, методы исследования, а также химия поверхности полимерных макропористых сорбентов монолитного типа. Второй раздел посвящен способам создания биоаффинных разделительных фаз (нековалентная, ковалентная и ориентационная иммобилизация, прямой твердофазный синтез пептидов на поверхности носителя). В третьем разделе обсуждаются основы микроанализа, материалы, используемые для создания операционных слоев биочипов, методы детектирования целевого белка в исследуемом образце.





Глава 2. Экспериментальная часть содержит описание использованных в работе материалов, оборудования, а также методов синтеза и исследования получаемых полимерных материалов.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

К несомненным достоинствам монолитных сорбентов на основе сополимера глицидилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата (ГМА-ЭДМА) можно отнести механическую и химическую стабильность, а также наличие в структуре сополимера реакционно-способных эпоксидных групп, позволяющих проводить одностадийную ковалентную поверхностную иммобилизацию макромолекул белка. Однако существенным недостатком данного материала является длительность процесса связывания лиганда с участием эпоксидных групп, а также недостаточно высокая адсорбционная емкость носителя.

Поэтому в представляемой работе синтезированы два новых макропористых монолитных сорбента на основе тройного сополимера N-гидроксифталимидного эфира акриловой кислоты, глицидилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата (ГФИАК-ГМА-ЭДМА), а также сополимера 2-цианоэтилметакрилата с этиленгликольдиметакрилатом (ЦЭМА-ЭДМА). Полученные полимерные материалы, наряду с известным ГМА-ЭДМА твердым сополимером, в дальнейшем были использованы в качестве разделительной фазы в конструируемых микроаналитических устройствах (биочипах).

Важной особенностью динамических процессов, основанных на межфазовом распределении вещества, с использованием макропористых монолитных носителей является возможность полного протекания подвижной фазы сквозь слой сорбента, что исключает диффузионные ограничения нормальному массопереносу, характерные для колонок, упакованных дисперсным сорбентом. Однако при реализации биоспецифических (аффинных) взаимодействий в непроточном формате, необходимо учитывать, что в данном случае молекулы анализируемого вещества достигают специфических адсорбционных сайтов без участия потока жидкости, т. е. исключительно за счет собственной диффузии. Поэтому определяющим этапом представляемого исследования являлась оптимизация процессов синтеза обсуждаемых сополимеров, которые должны обладать необходимыми поровыми характеристиками. При этом подразумевается гомогенность поровой структуры, а также размер пор, обеспечивающий, с одной стороны, свободное проникновение крупных молекул белка внутрь трехмерного порового пространства как в процессе иммобилизации, так и при последующем аффинном взаимодействии растворимого и связанного с поверхностью комплементов, а с другой, достаточную поверхность для достижения оптимальной адсорбционной емкости носителя.

3.1. Синтез и исследование свойств сополимеров ГМА-ЭДМА, ГФИАК-ГМА-ЭДМА и ЦЭМА-ЭДМА.

Синтез сополимеров осуществляли методом фотоинициируемой свободно-радикальной полимеризации в присутствии порогенных растворителей. В качестве инициатора использовали 2-гидрокси-2,2-диметилацетофенон (Дарокур-1173). Наличие в структуре полимерных продуктов функциональных групп основного мономера подтверждали методом ИК-спектроскопии. Так, о присутствии гидроксифталимидного фрагмента в структуре сополимера ГФИАК-ГМА-ЭДМА свидетельствуют характеристические полосы при 1788 и 1817 см-1, которые можно отнести к валентным колебаниям карбонильной связи эфирной и имидной групп. Детектируемая в ИК-спектре сополимера ЦЭМА-ЭДМА характеристическая полоса при 2260 см-1 отвечает валентным колебаниям связи углерод-азот нитрильной группы.

Для решения задачи направленного формирования поровой структуры, оптимальной для проведения биологического микроанализа, было исследовано влияние параметров фотоинициируемой полимеризации на поровую структуру получаемого полимерного продукта. Синтез сополимеров осуществляли в условиях вариации концентрации инициатора, времени облучения, а также природы и соотношения порогенных растворителей. Как видно из графика, представленного на Рис. 1 а, максимальный выход для всех трех сополимеров достигается при концентрации инициатора 0.8-1.0 масс%. Дальнейшее увеличение концентрации Дарокура-1173 не оказывало влияния на выход продуктов реакции, но при этом сопровождалось появлением более плотных участков на поверхности монолитного слоя. Причина этого явления заключается в формировании высокосшитых участков сополимера, практически лишенных пор или содержащих поры очень маленького размера.

С целью определения оптимального времени облучения была исследована зависимость выхода сополимеров от времени фотоинициируемой полимеризации (Рис. 1 б). Максимальный выход для сополимеров ГМА-ЭДМА и ЦЭМА-ЭДМА достигался через 20 минут облучения, тогда как для тройного сополимера ГФИАК-ГМА-ЭДМА этот параметр составлял 30 минут.

Рис. 1. Зависимость выхода сополимеров от концентрации инициатора (а) и времени реакции (б).

3.1.1. Зависимость поровых характеристик сополимеров ГМА-ЭДМА,

ГФИАК-ГМА-ЭДМА и ЦЭМА-ЭДМА от природы порогенных растворителей.

С целью получения монолитных макропористых носителей со средним размером пор (не менее 1 мкм), обеспечивающим свободное проникновение молекул белка внутрь порового пространства и высокую адсорбционную емкость носителя, было изучено влияние различных порообразующих агентов и их комбинаций на поровые характеристики получаемого полимерного материала.

При синтезе сополимера ГМА-ЭДМА, по аналогии с опубликованными данными для процессов термоинициируемой полимеризации, в качестве порообразующих веществ были использованы циклогексанол и додеканол. Однако в нашем случае проведенные исследования показали отсутствие существенного влияния соотношения циклогексанола и додеканола как на скорость фотоинициируемого процесса, так и на средний размер пор полученных полимерных образцов (Табл. 1).

Таблица 1

Данные интрузионной ртутной порометрии для сополимера ГМА-ЭДМА



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 

Похожие работы:







 
© 2013 www.dislib.ru - «Авторефераты диссертаций - бесплатно»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.