авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ РОССИЙСКАЯ БИБЛИОТЕКА - WWW.DISLIB.RU

АВТОРЕФЕРАТЫ, ДИССЕРТАЦИИ, МОНОГРАФИИ, НАУЧНЫЕ СТАТЬИ, КНИГИ

 
<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:   || 2 |

Создание и применение методов количественной протеомики с использованием и без использования изотопного мечения

-- [ Страница 1 ] --

Российская академия наук

Институт энергетических проблем химической физики

____________________________________________________________

На правах рукописи

АГРОН ИЛЬЯ АЛЕКСАНДРОВИЧ

Создание и применение методов количественной протеомики с использованием и без использования изотопного мечения

01.04.17 – химическая физика, горение и взрыв, физика экстремальных состояний вещества

автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата физико-математических наук

Москва, 2011г.

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте энергетических проблем химической физики РАН

Научный руководитель:

доктор физико-математических наук, профессор

Николаев Евгений Николаевич

Официальные оппоненты:

Доктор физико-математических наук, профессор

Барашев Петр Петрович

Доктор химических наук

Трофимов Алексей Владиславович

Ведущая организация:

Московский физико-технический институт (Государственный университет)

Защита состоится «26» октября 2011г. в 11 час. 00 мин. на заседании диссертационного совета Д 002.112.01 при Институте энергетических проблем химической физики Российской академии наук по адресу: 119334, г. Москва, Ленинский проспект, д. 38, корп.1, актовый зал ИХФ и ИНЭП ХФ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической физики им. Н.Н. Семенова Российской академии наук.

Автореферат разослан «24» сентября 2011г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д.002.112.01

кандидат физико-математических наук Ларичев М.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Введение и актуальность проблемы

При помощи современных методов, основанных на масс-спектрометрическом анализе, можно исследовать биологические объекты самого разного происхождения и сложности. Это стало возможным благодаря открытию новых методов ионизации вещества: метода электроспрей и метода лазерной десорбции/ионизации из матрицы (МАЛДИ) – которые позволили переводить в газовую фазу и одновременно ионизировать большие биологические молекулы, такие как пептиды, белки и полинуклеотиды. Среди методов масс-спектрометрии, используемых в протеомных исследованиях, масс–спектрометрия ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье (ИЦР ПФ) занимает особое место. Главными достоинствами этого метода являются: сверхвысокая разрешающая способность и рекордная точность измерения масс. С помощью современного масс-спектрометра ИЦР ПФ можно однозначно как идентифицировать индивидуальные биомолекулы, так и определять состав их смесей.

В настоящее время полностью расшифрованы геномы различных организмов, в том числе и человека. В связи с исследованиями многообразия белков, содержащихся в различных биологических объектах, возникла новая фундаментальная концепция, названная «протеом» (ПРОТЕиновое дополнение к генОМу). Создана новая дисциплина - протеомика, которая призвана дополнить и аннотировать информацию, содержащуюся в геномах. Современная масс-спектрометрия (в том числе, и ИЦР ПФ) занимает передовые позиции в решении основной задачи протеомики идентификация белков. В настоящее время также ведется активная разработка масс-спектрометрических методов количественного анализа протеомов.



Масс-спектрометр ИЦР ПФ обладает ограниченным динамическим диапозоном, в то же время, протеомы различных организмов содержат белки в широком диапазоне относительных концентраций. И поэтому необходимо использовать масс-спектрометрии ИЦР ПФ в комбинации с существующими методами разделения (жидкостная хроматография, электрофорез). Время удерживания пептида (продукта гидролиза белка энзимом трипсин) на хроматографе может являться дополнительным параметром при идентификации пептида.

В работе разрабатывались и оптимизировались методы, использующие масс-спектрометрию ИЦР ПФ для исследования протеомного состава одной из физиологических жидкостей человека – мочи. В работе были разработаны и использованы новые подходы для обработки и интерпретации полученных данных, в том числе, для сравнительного количественного анализа протеома. Также проводилась разработка подхода для совмещения методов атомно-силового микроскопа и масс-спектрометрии, где масс-спектрометрические методы использовались для идентификации молекул, обнаруживаемых АСМ.

Цели и задачи

  1. разработать хромато-масс-спектрометрические методики анализа протеомного состава мочи человека;
  2. разработать и применить в реальных исследованиях метод точной массово-временной метки для анализа протеома мочи;
  3. создать новую базу данных, состоящую из точных массово-временных меток, для быстрого поиска и идентификации белков содержащихся в моче человека;
  4. разработать методику сравнительного количественного анализа протеома, реального биологического объекта;
  5. разработать подход масс-спектрометрической идентификации белков детектируемых методами атомно-силовой микроскопии.

Научная новизна работы

  1. Cоздана база данных точных массово-временных меток триптических пептидов протеома мочи человека.
  2. Cоздана новая процедура нормирования времен удерживания на колонке жидкофазного хроматографа триптических пептидов белков, содержащихся в моче человека, которая может быть использована для идентификации белков методом точных массово-временных меток.

3. Разработан новый метод для сравнительного количественного анализа на основе использования методов точной массово-временной метки и изотопного мечения с применением концепции гипотетической аминокислоты «аверагин» для коррекции значений интенсивности пиков пептидов в спектрах.

4. Исследован протеомный состав мочи здорового человека, при помощи новой хромато-масс-спектрометрической методики, основанной на методе точной массово-временной метки. Обнаружено 39 новых генных продуктов.

5. Предложен подход совместного использования методов атомно-силовой микроскопии и масс-спектрометрии для идентификации и количественного определения содержания белков при сверхмалых концентрациях.

Практическая значимость работы

Разработанные хромато-масс-спектрометрические подходы для качественного и количественного анализа биологических жидкостей человека могут быть использованы при разработке методов диагностики различных патологий, вызванных, в том числе, заболеваниями.

Новая база данных точных массово-временных меток может использоваться для высокопроизводительного анализа протеома мочи человека при поиске биомаркеров различных заболеваний.

Подход, разработанный для идентификации белков, детектируемых методами атомно-силовой микроскопии может применяться для исследования других объектов, содержащихся в сверхнизких концентрациях в реальных биологических жидкостях.

Личный вклад автора

Материал, представленный в диссертации, получен при непосредственном участии автора как в постановке задачи, так и при проведении исследований. База данных точных массово-временных меток создавалась автором совместно с Д.М. Автономовым (ИНЭП ХФ РАН), И.А. Поповым (ИБХФ РАН) и А.С. Кононихиным (ИНЭПХФ РАН). Метод количественного анализа был разработан автором совместно с Д.М. Автономовым (ИНЭП ХФ РАН). Подход к совместному использованию методов атомно-силовой микроскопии и масс-спектрометрии был разработан совместно с А.С. Батуриным, Е.В. Дедковой (МФТИ (ГУ)). Диссертационная работа выполнена в Институте энергетических проблем химической физики Российской академии наук, в Лаборатории ионной и молекулярной физики, часть работ выполнялась автором параллельно в Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук в период с 2005 по 2011 год.

Защищаемые положения

  1. новая база данных точных массово-временных меток триптических пептидов протеома мочи;
  2. новый метод количественного анализа протеома физиологических жидкости человека, основанный на использовании методик точной массово-временной метки и изотопного мечения триптических пептидов изотопом 18O;
  3. новая процедура нормирования времен удерживания на хроматографической колонке и идентификации пептидов;
  4. метод идентификации белков при сверхмалых концентрациях с использованием масс-спектрометрии и атомно-силовой микроскопии.

Апробация работы

Результаты работы докладывались на следующих российских и международных конференциях: 58-ая Ежегодная конференция американского масс-спектрометрического общества «Масс-спектрометрия и смежные темы», Солт Лейк Сити, США, 23-27 мая 2010; 4-я Всероссийская конференция «Фундаментальные вопросы масс-спектрометрии и ее аналитические применения», Звенигород, Россия, 10 -14 октября 2010; 8-ая Международная конференция организации “Протеом Человека” (HUPO), Торонто, Канада, 26-30 сентября 2009; 57-ая Ежегодная конференция американского масс-спектрометрического общества «Масс-спектрометрия и смежные темы», Филадельфия, США, июнь 2009.

Публикации

Основное содержание диссертации опубликовано в работах, список которых приводится в конце автореферата. Работы, результаты которых изложены в диссертации выполнены при поддержке грантов РФФИ, INTAS, Миннауки.

Структура и объем диссертации

Работа изложена на 87 страницах, содержит 19 рисунков и 2 таблицы. Диссертация состоит из четырех глав, заключения и списка цитируемой литературы.

Список сокращений, используемых в тексте автореферата

ИЦР ПФ ионный циклотронный резонанс с преобразованием Фурье;

AMT – подход точной массово-временной метки (accurate mass and time tags database);

LC – высокоэффективная жидкофазная хроматография (liquid chromatography);

MS – масс-спектрометрия (mass-spectrometry);

MS/MS – тандемная масс-спектрометрия;

CID столкновительно-индуцированная фрагментация (collision induced dissociation);

ECD фрагментация при захвате медленнего электрона (electron capture dissociation);

IRMPD – инфракрасная мультифотонная диссоциация (infrared multi photon dissociation);

АСМ – атомно-силовая микроскопия.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Первая глава является литературным обзором, в котором дается краткое описание объекта исследования (моча человека), обсуждаются трудности и ограничения стандартных методов исследования протеома мочи (нисходящий и восходящий подходы протеомного анализа, подход точной массово-временной метки), обсуждаются возможности и преимущества применения масс-спектрометрии ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье (ИЦР ПФ) в комбинации с различными методами фрагментации и ионизации биомакромолекул, с высокоэффективной жидкостной хроматографией и новыми методами обработки масс-спектров ИЦР.

Однозназначная идентификация, как индивидуальных биомакромолекул, так и их смесей напрямую связана с точностью измерения масс, поэтому в обзоре особое внимание уделено обсуждению этой характеристики.

Точность измерения масс и разрешение в масс-спектрометрии ИЦР ПФ

Измеряемой величиной в масс-спектрометрии ИЦР ПФ является частота, по значению которой можно рассчитать массу иона используя общепринятое калибровочное выражение:

,

где m и z – масса и заряд иона, соответственно, - измеряемая частота. Коэфиценты А и В являются постоянными величинами и расчитываются при калибровке масс-спектрометра по двум или более известным массам. Выражение (1) получается в приближении одного иона и не учитывает влияние объемного заряда и кулон-кулоновского взаимодействия между ионами. На практике для более точных измерений используется внутренняя калибровка масс-спектрометра, когда в образце содержатся одновременно исследуемое вещество и калибрант, поскольку, ионы калибранта вместе с ионами исследуемого вещества, подвержены одинаковым эффектам, искажающим точность измерения масс. Также проводят точные измерения с использованием внешней калибровки, при этом калибрант вводят отдельно от исследуемого вещества, если для каждого измерения в ИЦР ячейку захватывается примерно одинаковое число ионов.





В работе все измерения производились на гибридном масс-спектрометре Finnigan LTQ FT (Thermo Electron, Бремен, Германия; Рис. 1), который состоит из масс-спектрометра ИЦР ПФ со сверхпроводящим соленоидом (7 Тесла) и высокочувствительной линейной квадрупольной ионной ловушки.

 Схема гибридного масс-спектрометра-3

Рис. 1. Схема гибридного масс-спектрометра Finnigan LTQ FT.

Изображенный на Рис. 1 гибридный масс-спектрометр является одним из самых современных приборов в своем классе и позволяет проводить измерения в режиме ИЦР ПФ с максимальным разрешением R=500000 для m/z=400 и точностью измерения масс 2ppm (при использовании внешней калибровки). Главными достоинствами прибора являются автоматический контроль числа ионов в масс-анализаторе и возможность использовать современные методы ионизации (электроспрей, атмосферный МАЛДИ) и фрагментацию биомакромолекул (в линейной квадрупольной ионной ловушке реализована столкновительно индуцированная фрагментация (CID), в ячейке ИЦР - инфракрасная мультифотонная диссоциация (IRMPD) и диссоциация, происходящая при захвате медленных электронов (ECD)). Последний из перечисленных методов фрагментации в отличии от двух первых позволяет получить осколки пептидов, образованные не по пептидной связи, а по связи N-C(альфа), так называемые c-, z-фрагменты.

Масс-спектрометрия ионного циклотронного резонанса была выбрана по причине максимальной точности измерения масс (в сравнении с другими масс-спектрометрическими методами- времяпролетная масс-спектрометрия, ионная ловушка, Орбитрэп), и достаточно высокой скорости измерения спектров для совмещения с хроматографическим методом разделения триптических пептидов, что необходимо для работы с использованием метода точной массово-временной метки, который в свою очередь, позволяет добиться минимального времени проведения эксперимента, количества образца и понижения порога чувствительности (из-за отказа от MS/MS).

Количественные методы в протеомике глобально подразделяются на два типа: с применением и без применения изотопных меток.

Изотопные метки для попарного сравнения образцов (для задач протеомики) начали разрабатываться с самого начала применения в этой области тандемной хромато-масс-спектрометрии (LC-MS/MS). Метод основан на том, что в результате мечения пептиды в опытном и контрольном образцах дают пики в масс-спектрах, отстоящие друг от друга на несколько единиц массы. Метки конструируют таким образом, чтобы они не влияли на эффективность ионизации и времена хроматографического удерживания. По отношению интенсивностей пиков соответствующих пептидов определяют их относительное содержание в образцах.

Разработано несколько коммерчески доступных решений для проведения сравнительного количественного анализа протеомов. Примерами могут служить технологии ICAT (Isotope-Coded Affinity Tag) и ICROS (Isotope Coded Reduction Off of Chromatographic Support), в которых мечение производится по цистеиновому остатку. Более сложной является технология iTRAQ (Isobaric Tagging Reagents Amino-reactive Quantification), которая позволяет проводить количественный анализ сразу 4 образцов – но с использованием MS/MS. Изобарные (имеющие одинаковые массы) метки в iTRAQ связываются с N-концевым остатком пептидной цепи. Одним из методов модификации для количественного анализа является гуанидирование лизинового остатка пептидов.

Для сравнительного количественного анализа протеомов нами было использовано более простое и экономичное C-концевое ферментативное мечение изотопом кислорода 18О. Использование 18О-атома в качестве метки известно еще с работ Спирсона (Spirson) и Риттенберга (Rittenberg) 1951-го года, которые исследовали механизм ингибирования продуктов реакции гидролиза амидной связи химотрипсином. При применении 18О/16О изотопного мечения получаются химотриптические пептиды, меченые по С-концу независимо от их аминокислотной последовательности. Благодаря ряду преимуществ, таких как относительно несложная химия и сдвиг массы на строго определенную величину, 18О/16О изотопное мечение стало популярным методом в количественной протеомике. Однако из-за слишком малой разницы масс между изотопами (всего 2 или 4 Да) этот подход применяется только в сочетании с масс-спектрометрами сверхвысокого разрешения (R порядка 500000).

Также в первой главе приводится обзор литературы, посвященной методу атомно-силовой микроскопии и методикам совмещения АСМ и масс-спектрометрии для идентификации биомолекул. Описаны концентрационные критерии для возможности совмещения этих методов.

Во второй главе описывается хромато-масс-спектрометрическая методика, разработанная для анализа протеома мочи человека, процедура создания базы данных метода точных массово-временных меток, структура базы и методы поиска и идентификации белков, содержащихся в моче человека, с ее использованием.

Процедура анализа протеома мочи человека строилась на стандартном подходе, который используется в протеомике биологических жидкостей и состоящем из следующих этапов: (1) отбор пробы содержащей белки; (2) очистка, концентрирование и предварительное разделение смеси белков; (3) энзиматическое расщепление белков – получение смеси пептидов; (4) хромато-масс-спектрометрический анализ смеси пептидов; (5) поиск и идентификация белков.

Хромато-масс-спектрометрическая методика анализа смеси пептидов была разработана на базе нанопоточного высокоэффективного жидкостного хроматографа (нано-ВЭЖХ) Agilent 1100 (Agilent, США) и масс-спектрометра Finnigan LTQ FT (Thermo Electron, Бремен, Германия). Для соединения нано-ВЭЖХ с масс-спектрометром использовался наноспрейный ионный источник, который был разработан и собран в лаборатории.

Разделение смеси пептидов при помощи нано-ВЭЖХ проводилось методом градиентного элюирования – подвижная фаза В (80% ацетонитрил + 20% вода + 0,1% муравьиной кислоты) изменялась от 3% до 35% в течение 120 минут, скорость потока подвижной фазы была 0,3мкл/мин.

Масс-спектрометрический анализ фракций пептидов осуществлялся при помощи программы Xcalibur (Thermo Electron, Бремен, Германия) в двухстадийном режиме автоматического измерения спектров. На первой стадии в масс-спектрометре ИЦР ПФ измерялись точные массы пептидов в диапазоне m/z 300-1600, с разрешением R=25000 для m/z 400 (число ионов в ячейке ИЦР: 5*106). На второй стадии из ИЦР масс-спектра выбирались три максимальных пика, для которых производилась либо столкновительно индуцированная фрагментация (CID), либо фрагментация, при захвате медленных электронов (ECD). Фрагментация CID и измерение спектров CID фрагментов происходили в линейной квадрупольной ионной ловушке (число ионов: 3*104). Фрагментация ECD и измерение спектров ECD фрагментов осуществлялись в ИЦР-ячейке (число ионов: 5*105). В режиме автоматического двухстадийного анализа пептиды, для которых фрагментация уже была проведена, динамически исключались из исследования на 30 секунд.



Pages:   || 2 |
 

Похожие работы:










 
© 2013 www.dislib.ru - «Авторефераты диссертаций - бесплатно»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.