авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ РОССИЙСКАЯ БИБЛИОТЕКА - WWW.DISLIB.RU

АВТОРЕФЕРАТЫ, ДИССЕРТАЦИИ, МОНОГРАФИИ, НАУЧНЫЕ СТАТЬИ, КНИГИ

 
<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:   || 2 | 3 |

Пространственная структура медных полиядерных оксидаз – лакказ coriolus zonatus и cerrena maxima

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

УДК 548.737

ЛЯШЕНКО АНДРЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА МЕДНЫХ ПОЛИЯДЕРНЫХ ОКСИДАЗ – ЛАККАЗ Coriolus zonatus и Cerrena maxima

Специальность 01.04.18 – кристаллография, физика кристаллов

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

Москва – 2006

Работа выполнена в Институте кристаллографии имени А.В. Шубникова Российской академии наук

Научный руководитель: кандидат физико-математических наук, доцент

Михайлов Альберт Михайлович

(специальность 01.057 – кристаллография и

кристаллофизика)

кандидат физико-математических наук

Габдулхаков Азат Габдрахманович

(Институт белка РАН)

(специальность 03.00.02 – биофизика)

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Мчедлишвили Борис Викторович

(Институт кристаллографии РАН)

доктор физико-математических наук

Лунин Владимир Юрьевич

(Институт математических

проблем биологии РАН)

Ведущая организация: Институт биоорганической химии РАН

Защита диссертации состоится « » декабря 2006 г. в «11час.00 мин» на заседании Диссертационного совета Д002.114.01 в Институте кристаллографии имени А.В. Шубникова РАН по адресу: 119333 Москва, Ленинский проспект, 59

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института кристаллографии имени А.В. Шубникова РАН

Автореферат разослан « » _______2006 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат физико-математических наук В.М. Каневский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Лакказа (монофенол, дигидроксифенилаланин: кислород оксидоредуктаза (КФ 1.14.18.1)) относится к классу медьсодержащих оксидаз и катализирует реакцию восстановления молекулярного кислорода различными органическими и неорганическими соединениями непосредственно до воды. Являясь одним из основных лигнолитических ферментов, лакказа играет ключевую роль в процессе деградации лигнина. Проблеме биоконверсии и, в частности, биодеградации одного из самых устойчивых к химическому и микробиологическому разложению биополимера – лигнина в настоящее время уделяется большое внимание. Неспецифичность ферментов лигнолитического действия и их высокая окислительная способность открывает широкие возможности для использования как самих лигнолитиков, каковыми являются базидиальные грибы, относящиеся к белой гнили, так и их лигнолитических ферментов в системах детоксификации и деградации ксенобиотиков и ремедиации загрязненных территорий.

Способность лакказ катализировать реакцию электровосстановления кислорода по безмедиаторному механизму привлекает большое внимание к изучению свойств фермента различными методами. Интерес к изучению лакказ обусловлен возможностью их широкого применения в биотехнологии, в том числе и для создания биосенсоров различного типа, а также альтернативных источников тока. Феномен прямого переноса электрона с электрода на активный центр лакказы является теоретической базой для создания биосенсоров и биотопливных элементов третьего поколения, которые, в свою очередь, являются фундаментальной основой для создания нанобиоустройств с высокой эффективностью электронного транспорта, достаточной для нормального функционирования микробиочипов и микроманипуляторов. Таким образом, лакказа является одним из ферментов, чьи каталитические свойства обеспечивают возможность ее широкого применения в различных отраслях биотехнологии. Для эффективного применения фермента необходимо знание механизма его действия и структуры. Однако, несмотря на более чем 100-летнюю историю исследования лакказы, широкий круг вопросов, касающихся каталитического механизма действия фермента, особенностей его биосинтеза, регуляции активности и физиологической роли остается пока невыясненным. Взаимосвязь структура – функция для данного фермента остается вопросом, требующим дальнейшего изучения. Решение данной задачи является актуальным как с теоретической (принципы организации и функционирования медьсодержащих оксидаз), так и с практической точки зрения (использование фермента для делигнификации, биоремедиации, биосенсорных технологий и конверсии лигнинсодержащего сырья и отходов).



Цель работы. Целью данной работы являлось выделение и очистка белка; выращивание монокристаллов высокого качества, пригодных для исследования методами рентгеноструктурного анализа; получение рентгенодифракционных наборов интенсивностей с использованием синхротронного излучения и их обработка; решение и уточнение атомных структур ферментов лакказ Coriolus zonatus и Cerrena maxima; установление на основе полученных данных взаимосвязи между структурой и функцией этих медьсодержащих оксидаз.

Научная новизна работы. Выделены и очищены два белка - Coriolus zonatus и Cerrena maxima. Проведён поиск условий кристаллизации и выращены высокосовершенные кристаллы, пригодные для рентгеноструктурного анализа. Впервые определены пространственные структуры двух лакказ Coriolus zonatus и Cerrena maxima с разрешением 2.6 и 1.9 соответственно. Проведён детальный анализ пространственных структур лакказ Coriolus zonatus и Cerrena maxima, в том числе:

  • локализация двух водных каналов, обеспечивающих доступ к трехъядерному медному центру, в молекулах лакказ Coriolus zonatus и Cerrena maxima;
  • локализация системы карбогидратов, образующих сеть водородных связей с атомами основной цепи и атомами боковых радикалов белковой молекулы, способствующей кристаллизации лакказ Coriolus zonatus и Cerrena maxima;
  • обнаружение в остатках Tyr196 и Tyr372 в орто-положениях тирозиновых циклов NO2-заместителей;
  • предложен механизм каталитического действия фермента лакказы Cerrena maxima, подтверждающий ранее предложенный механизм для лакказы Coriolus hirsutus.

Практическая значимость работы. Полученные знания о пространственной организации молекул изученных лакказ служат основой для понимания действия полимедных оксидаз, представителями которых являются лакказы. Выяснение механизма каталитического действия этого фермента является фундаментальной основой, в частности, при разработке экологически чистых биотехнологий для обработки лигнинсодержащих материалов и для утилизации отходов, для их применения при создании биосенсоров различного типа. Координаты атомов молекул лакказ Cerrena maxima и Coriolus zonatus депонированы в Protein Data Bank (коды: 2H5U и 2HZH соответственно).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 4 статьи в рецензируемых отечественных и зарубежных журналах. Список публикаций приведен в конце автореферата.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов, списка цитируемой литературы. Она изложена на 168 страницах, содержит 43 рисунка и 12 таблиц.

Основные положения, выносимые на защиту:

  1. Отработка методик получения высокогомогенных препаратов и выращивание высокосовершенных кристаллов лакказ Coriolus zonatus и Cerrena maxima.
  2. Получение экспериментальных наборов интенсивностей от монокристаллов лакказ Coriolus zonatus и Cerrena maxima с использованием синхротронного излучения и их обработка.
  3. Определение и уточнение пространственной организации молекул лакказ Coriolus zonatus и Cerrena maxima с атомным разрешением.
  4. Установление первичных структур лакказ Coriolus zonatus и Cerrena maxima на основании результатов рентгеноструктурного анализа ферментов.
  5. Проведён детальный анализ пространственных структур лакказ Coriolus zonatus и Cerrena maxima, в том числе:
  • локализация двух водных каналов, обеспечивающих доступ к трехъядерному медному центру, в молекулах лакказ Coriolus zonatus и Cerrena maxima;
  • локализация системы карбогидратов, образующих сеть водородных связей с атомами основной цепи и атомами боковых радикалов белковой молекулы, способствующей кристаллизации лакказ Coriolus zonatus и Cerrena maxima;
  • обнаружение в остатках Tyr196 и Tyr372 в орто-положениях тирозиновых циклов NO2-заместителей.

Личный вклад автора. Выделение и очистка белка, выращивание кристаллов, участие в сборе рентгенодифракционных отражений, обработка полученных данных. Проведение расчетов, связанных с решением и уточнением пространственных структур лакказ. Анализ атомных моделей молекул с целью выяснения особенностей их строения, локализации активных центров, гликозидных компонент молекул, а также установление не известных ранее первичных структур этих лакказ.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на V Национальной конференции по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования наноматериалов и наносистем (Москва 2005), на 10-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино 2006), на XII Национальной конференции по росту кристаллов (Москва 2006).

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Введение. Во введении дана краткая характеристика лакказ, обоснована актуальность темы, необходимость фундаментальных исследований этого фермента.

Глава 1. Лакказа фермент семейства «голубых» полимедных оксидаз (по литературным данным).

В этой главе изложены аспекты, касающиеся возможного пути эволюции полимедных оксидаз, дана краткая характеристика различных лакказ, приводятся сведения о некоторых свойствах этих ферментов – спектроскопических, магнитных, окислительно-восстановительных. «Голубые» медьсодержащие ферменты являются полидоменными белками, использующими уникальное окислительно-восстановительное свойство меди. Полимедные белки состоят из тандема повторяющихся аналогичных по своей последовательности доменов, которые в некоторых аспектах гомологичны однодоменным белкам купредоксинового ряда. Увеличение числа купредоксиновых доменов с последующими модификациями, такими как создание междоменных медьсвязывающих сайтов и субстрат-связывающих центров, привело к формированию полимедных «голубых» белков.

Лакказы являются трехдоменными полимедными «голубыми» белками, обнаруженными в грибах, деревьях, насекомых, бактериях. Они могут осуществлять полное восстановление молекулярного кислорода до двух молекул воды. У лакказ довольно низкая специфика в отношении окисляемых субстратов. Эти ферменты – гликопротеины, углеводная часть которых может достигать 45% от молекулярной массы. Активный центр лакказ содержит ансамбль из четырех ионов меди. Классификация медь-связывающих центров во всех многоядерных медных оксидазах основана на различии их спектральных и магнитных свойств.

Глава 2. Материалы и методы.

В главе описаны биологические и химические материалы, использованные при выполнении настоящего исследования. На основании литературных данных приведены краткие обзоры, посвященные описанию принципов кристаллизации биомакромолекул, методам уточнения атомной структуры белков, способам оценки качества модели в процессе уточнения кристаллической структуры.

Глава 3. Экспериментальная часть.

Выделение и очистка лакказы Coriolus zonatus. В качестве штамма-продуцента лакказы использовали Coriolus zonatus из коллекции Института биохимии им. А.Н.Баха (GenBank Accession number Trametes ochracea – AB158314). Штамм хранили на агаризованных косяках, которые готовили путем разбавления сусла водой с соотношением объемов 1:4, добавляя 2% агар при температуре +4С, реверзум не окрашен. Выращивание посевного материала проводили поверхностным способом на питательной среде (начальное значение рН 6.0), содержавшей пептон - источник азота, глюкозу - источник углерода и минеральные соли при температуре 25-27оС. Во всех экспериментах использовали среду следующего состава (г/л): глюкоза – 10.0; пептон - 3.0; КН2РО4 - 0.6; ZnSO4·7H2O - 0.001; К2НРО4 - 0.4; FeSO4·7H2O - 0.0005; MnSO4 - 0.05; MgSO4·7H2O - 0.5. При глубинном культивировании продуцента гриба Coriolus zonatus в питательную среду вышеуказанного состава вносили CuSO4 и CаCl2 в количествах 0.15 г/л и 0.5 г/л соответственно. Раствором NaOH или уксусной кислотой доводили значение рН среды до 6.0. Среду стерилизовали автоклавированием при 1 атм. в течение 30 мин. После окончания процесса культивирования культуральный фильтрат отделяли от мицелия путем фильтрования и проводили глубинное замораживание при температуре -40оС.





Внеклеточную лакказу Coriolus zonatus выделяли при комнатной температуре из культуральной жидкости (рН 5.0) путем осаждения 90%-ным сульфатом аммония в течение 2 ч при постоянном перемешивании. Осадок собирали центрифугированием при 2500g в течение 30 мин и растворяли его вновь в минимальном объеме дистиллированной воды. Далее препарат наносили на колонку (100х2 см) с сефадексом G-25, уравновешенную 5 мМ Кфосфатным буфером (КФБ), рН 6.0. Элюцию проводили тем же буфером. Фракцию, соответствующую пику ферментативной активности, наносили на колонку (2х20 см) с DEAE-Toyopearl 650 M, уравновешенную 5 мМ КФБ, рН 6.0. Белок элюировали линейным градиентом ионной силы 2х150 мл, создаваемой КФБ, рН 7.2, с молярностью от 5 мМ до 200 мМ. Активные фракции объединяли и после диализа против 5 мМ КФБ, рН 6.0, рехроматографировали на колонке с DEAE-Toyopearl 650 M в тех же условиях, но с более пологим градиентом ионной силы (2х250 мл). Для получения высокогомогеннного препарата фермента, необходимого для кристаллизации, на заключительном этапе использовали метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе FPLC, используя колонку для гель-фильтрации TSK 3000. Элюцию проводили 50 мМ КФБ, рН 6.5, со скоростью 0.5 мл/ч. Гомогенность препарата контролировали методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS.

Кристаллизация лакказы Coriolus zonatus. Кристаллы лакказы C. zonatus (рис. 1а) выращены методом диффузии паров в висячей капле. Противораствор объемом 0.5 мл содержал 0.2 М сульфата аммония, 0.1 М ацетата натрия (pH 4.6), 25 % (w/v) полиэтиленгликоля 4000. Кристаллизационный раствор объемом 6 мкл состоял из белка с концентрацией 8 мг/мл в 50 мМ цитратном буфере (рН 5.5), 0.1 М сульфата аммония, 0.05 M ацетата натрия (pH 4.6), 12.5 % (w/v) полиэтиленгликоля 4000.

Сбор дифракционных данных для кристаллов лакказы Coriolus zonatus. Дифракционные интенсивности от кристаллов лакказы C. zonatus были собраны при температуре 100 К на станции BW6 (DESY, Гамбург, Германия, CCD–детектор) до разрешения 2.6 . В качестве криораствора был использован кристаллизационный противораствор с добавлением 15% (v/v) глицерина. Экспериментальный набор модулей структурных амплитуд получен с помощью программы XDS. Статистические данные этого набора представлены в табл. 1.

а б

Выделение и очистка лакказы Cerrena maxima. Штам-продуцент внеклеточной лакказы Cerrena maxima был получен из коллекции культур базидиомицетов Ботанического института им. В.Л.Комарова РАН (С.-Петербург) и хранились в коллекции Института биохимии им. А.Н.Баха РАН. Культивирование продуцента C. maxima проводили на пептон-глюкозной среде при условиях поверхностного и глубинного культивирования [1]. В конце периода ферментации культуральная жидкость была отделена от мицелия фильтрованием, а фильтраты сконцентрированы ультрафильтрацией с помощью фильтра-сита, удерживающего белки (полимеры) с молекулярной массой более 15 кДа. Для осаждения использован 90% сульфат аммония. Очистка препарата проведена методом ионообменной хроматографии на DEAE-Toyopearl 650M (Toyo Soda, Япония) Гомогенный препарат получен методом ЖХВД на колонке Superdex 200 (Pharmacia, Щвеция), предварительно уравновешенной 15 мМ К-фосфатным буфером, pH 6.5. Элюцию проводили тем же буфером. Лучшая изоформа использована для дальнейших исследований. Гомогенность лакказы была подтверждена методом SDS-PAGE электрофореза.

Кристаллизация лакказы Cerrena maxima. Кристаллы лакказы Cerrena maxima (рис. 1б) выращены методом диффузии паров в висячей капле. Кристаллизационный раствор (6 мкл) состоял из белка с концентрацией 8 мг/мл в 50 мМ цитрата натрия, 15 % (w/v) полиэтиленгликоля 6000 в 0.04 М трис-малеин-NaOH буфере, рН 5.5. Противораствор (0.5 мл) состоял из 30% (w/v) полиэтиленгликоля 6000 в 0.08 М трис-малеин-NaOH буфере, pH 5.5. Кристаллы выращивались при 298 К.

Сбор рентгенодифракционных данных для кристаллов лакказы Cerrena maxima. Дифракционные данные для кристаллов лакказы C. maxima были получены при низкой температуре (PEG-400 был использован в качестве криопротектора) на X13 (DESY, Гамбург, Германия) до разрешения 1.9 . Экспериментальный набор модулей структурных амплитуд для кристалла получен с помощью программы XDS [2]. Характеристики набора лакказы C. maxima и некоторые параметры съемки приведены в табл. 1.

Таблица 1. Характеристики наборов дифракционных данных для кристаллов лакказ

Белок C.zonatus C.maxima
Пространственная группа P321 (№ 154) P212121 (№ 19)
Параметры ячейки, , град a=b=168.93, c=69.35, ==90.0, =120.0 a=52.58, b=77.10, c=130.88, ===90.00
Молекулярная масса, кDa 60 60
Число молекул в независимой части 1 1
Длина волны, 1.05 0.8068
Разрешение, 145.86 - 2.60(2.67 - 2.60)* 19.28 - 1.9(1.95 - 1.90)*
Число измеренных рефлексов 175868 152040
Расстояние кристалл-детектор, мм 180 160
Область качания, град 0.5 0.6
Область вращения, град 80 120
Число независимых рефлексов 35011 31333
Повторяемость 5.02(4.75)* 4.85(3.36)*
Полнота набора, % 95.07(93.33)* 98.2 (96.8)*
Мозаичность, град 0.2 0.172
Среднее значение I/(I) 15.17 (4.27)* 5.04(1.87)*
Rmerge 7.1(24.4)* 11.2(31.9)*


Pages:   || 2 | 3 |
 

Похожие работы:







 
© 2013 www.dislib.ru - «Авторефераты диссертаций - бесплатно»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.