авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ РОССИЙСКАЯ БИБЛИОТЕКА - WWW.DISLIB.RU

АВТОРЕФЕРАТЫ, ДИССЕРТАЦИИ, МОНОГРАФИИ, НАУЧНЫЕ СТАТЬИ, КНИГИ

 
<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Фитохимическое и технологическое исследование листьев осины обыкновенной

-- [ Страница 2 ] --

Хроматографические и спектроскопические характеристики флавоноидов листьев осины обыкновенной

№ пика Время удерживания, мин. Максимумы поглощения, нм Заключение
Спиртовое извлечение (спирт этиловый 40%)
1 8,35 215, 240 пл., 325 хлорогеновая кислота
2 9,42 200, 260-263, 355 фенольное соединение
3 10,17 201, 325 фенолокислота
4 11,91 195,255, 355 гликозид или эфир флавонола или флавона
5** 13,90 204, 255, 355 рутин
6***** 15,11 204, 256, 355 гиперозид
7 16,24 204, 257, 350 кверцитрин
8* 16,58 194, 265, 350 гликозид или эфир флавонола или флавона
Гидролизат спиртового извлечения
6** 15,11 204, 256, 355 гиперозид
8 16,58 194, 265, 350 гликозид или эфир флавонола или флавона
9* 18,48 207, 254, 360 мирицетин
10 19,82 205, 263, 355 агликон или моногликозид флавонола или флавона
11**** 21,12 202, 255, >360 кверцетин
12* 24,18 197, 265, >360 кемпферол
Стандартные образцы
Мирицетин 18,48 207, 254, 360
Кверцетин 21,47 202, 255, >360
Кемпферол 24,58 197, 265, >360
Рутин 13,90 204, 255, 355
Гиперозид 15,11 204, 256, 355
Кверцитрин 16,24 204, 257, 350

Примечание: относительная величина наиболее выраженных пиков показана увеличением количества *.

Анализируя данные проведенных исследований (табл. 1), можно сделать вывод о том, что в спиртовом извлечении листьев осины присутствуют пять флавоноидов в форме гликозидов, три из которых по времени удерживания и характеру УФ-спектра в сравнении с аналогичными показателями СО идентифицированы как гиперозид, рутин и кверцитрин. Следует отметить, что гиперозид в данном сырье нами был обнаружен впервые. Гидролиз приводит к появлению четырех новых соединений в форме агликонов флавоноидов, три из которых по вышеуказанным показателям идентифицированы как мирицетин, кверцетин и кемпферол.



Фенологликозиды. Исследование фенологликозидов нативного водного извлечения из листьев осины методом ТСХ проводили на пластинках «Sorbfil ПТСХ-П-В» в системе растворителей этилацетат: п-ксилол: муравьиная кислота: вода (35:1:2:2) в сравнении с растворами СО салицина и тремулацина. В водном извлечении было установлено наличие восьми фенологликозидов, в том числе четырех фенологликозидов – производных салицина, приобретающих розовое окрашивание после обработки серной кислоты раствором 4% в спирте этиловом 95%, среди которых по величине Rf и характеру окрашивания в сравнении с аналогичными показателями СО пятно с Rf = 0,25 соответствует салицину, а пятно с Rf = 0,74 – тремулацину.

Изучение фенологликозидов вышеуказанного водного извлечения методом ВЭЖХ проводили на хроматографе Милихром А-02. Подвижная фаза: А – 0,01% водный раствор трифторуксусной кислоты (ТФУК); В – 100% ацетонитрил, градиент 5–55% элюента Б. Идентификацию соединений осуществляли по времени удерживания и характеру УФ-спектров, снятых в процессе хроматографирования, при этом было выявлено наличие восьми фенологликозидов, в том числе салицина (=8,35 мин; max – 212, 268 нм) и тремулацина (=23,78 мин; max – 194, 222, 272 нм), обнаруженных ранее в сырье методом ТСХ.

Фенолокислоты. Для изучения состава фенолокислот листьев осины обыкновенной методом ВЭЖХ на хроматографе «Милихром А-02» был получен «реэкстракт» спиртового извлечения при рН=2 (этилацетат: диэтиловый эфир (1:1)) с последующим удалением органических растворителей и растворении в спирте этиловом 40%.

Анализ времен удерживания, характера УФ-спектров и спектральных соотношений позволяет сделать заключение о том, что в составе эфирно- этилацетатного реэкстракта присутствуют четыре фенолокислоты и/или их эфиры, среди которых идентифицированы хлорогеновая кислота (=8,96 мин; max - 215, 240 пл., 325 нм) и эфиры п-кумаровой (=10,34 мин; max – 230, 302 пл., 312 нм), феруловой (=11,04 мин; max – 240, 325 нм) и коричной (=11,58 мин; max – 235, 315 нм) кислот.

Для выделения суммы фенольных соединений из листьев осины использовали известную методику с применением метода адсорбционной колоночной хроматографии на полиамидном сорбенте (Турецкова В.Ф., 2001). Простые фенольные соединения элюировали с колонки водой, после чего флавоноиды - спиртом этиловым 40%. На основе водного элюата получали сумму простых фенольных соединений, на основе спиртового – сумму флавоноидов. Изучение состава выделенных фенольных соединений осуществляли методом ВЭЖХ (рис. 1).

 Хроматограммы выделенных сумм-4

Рис. 1. Хроматограммы выделенных сумм флавоноидов (А) и простых фенольных соединений (Б) листьев осины обыкновенной

А Б

2 – рутин; 3 – гиперозид; 1 – салицин; 7 – эфир п-кумаровой

4 – кверцитрин кислоты; 9 – рутин;

10 – гиперозид; 15 – тремулацин

На хроматограмме выделенной суммы флавоноидов (рис. 1А) выявлено наличие пяти флавоноидов, обнаруженных ранее в сырье. Тождественность аналитических сигналов позволяет идентифицировать три из них как гиперозид, рутин и кверцитрин. На хроматограмме суммы простых фенольных соединений (рис. 1Б) обнаружено пятнадцать пиков, из которых по характеру УФ-спектров семь соединений отнесены к фенологликозидам, в том числе салицин и тремулацин, три – к производным фенолокислот, три – к флавоноидам и два – к фенольным соединениям, возможно являющимся ассоциированными производными фенологликозидов и фенолокислот. Обнаружение остаточных количеств флавоноидов в данной фракции, на наш взгляд, обусловлено их гликозидной формой. Учитывая невозможность окончательного разделения флавоноидов и простых фенольных соединений, была получена объединенная фракция, которая в дальнейшем использовалась для проведения фармакологических исследований.

Количественное содержание основных групп БАВ гидрофильной фракции листьев осины обыкновенной. Для определения количественного содержания флавоноидов в листьях осины был использован метод дифференциальной спектрофотометрии, в основе которого лежит реакция комплексообразования флавоноидов с алюминия хлоридом. Целесообразность использования данного метода подтверждается характером дифференциального спектра с максимумом поглощения при длине волны 412 нм, что характерно для хелатов флавоноидных соединений и, в частности, для флавонола гиперозида, содержащегося в данном виде сырья (рис. 2).

Рис. 2. УФ-спектры комплексов флавоноидов спиртового извлечения (спирт этиловый 40%) из листьев осины и СО гиперозида с алюминия хлоридом:

1 – флавоноиды спиртового извлечения; 2 – СО гиперозида

В результате проведенных исследований были выбраны оптимальный способ и время получения извлечения – 3 часа на магнитной мешалке; время протекания реакции комплексообразования – 30 минут; количество алюминия хлорида раствора 2% в спирте этиловом 40% – 2 мл и количество гексаметилентетрамина водного раствора 5% – 3 мл, а также определен удельный показатель поглощения гиперозида при длине волны 412 нм – 327,38±7,58. Экспериментальным путем установлены параметры линейности (коэффициент корреляции 0,9991), повторяемости (RSD = 3,84%), воспроизводимости (RSD = 4,00%) и правильности (критерий приемлемости = 99,31%) указанной методики, что говорит о возможности ее использования для стандартизации листьев осины обыкновенной.

В связи с близостью качественного и количественного состава фенологликозидов в коре и листьях осины их количественное содержание определяли методом прямой спектрофотометрии по методике, разработанной на кафедре фармацевтической технологии для коры осины обыкновенной, с предварительной очисткой водного раствора листьев осины от сложных фенольных соединений, при длине волны 268 нм в пересчете на салицин. Количественное содержание фенолокислот определяли широко используемым для определения данной группы БАВ методом прямой спектрофотометрии в пересчете на хлорогеновую кислоту (Бородіна Н.В., 2004). При этом были проведены дополнительные исследования по выбору оптимального экстрагента (спирт этиловый 40%), аналитической длины волны (325 нм), режима экстрагирования (3 часа на магнитной мешалке), подобраны необходимые разведения и определен удельный показатель поглощения хлорогеновой кислоты (517,66±10,46).

Целесообразность использования данных методов подтверждается характером УФ-спектра очищенного водного извлечения из листьев осины (=267±1нм) и УФ-спектра 40% спиртового извлечения листьев осины (=267±1нм; =322±4нм) соответственно (рис. 3, 4), а также результатами проведенной нами валидационной оценки, согласно которой методики обладают соответственно линейностью (коэффициенты корреляции 0,99913 и 0,99953), повторяемостью (RSD = 3,75% и 3,99%), промежуточной прецизионностью (RSD = 6,92% и 4,92%) и правильностью (критерий приемлемости = 99,25% и 99,50%).

 УФ-спектр очищенного водного-8

Рис. 3. УФ-спектр очищенного водного извлечения из листьев осины обыкновенной

Рис. 4. УФ-спектр 40% спиртового извлечения листьев осины обыкновенной

Для количественного определения дубильных веществ (суммы легкоокисляемых веществ) и полисахаридов были использованы стандартные методики – перманганатометрический метод согласно ГФ XI изд. и гравиметрический метод, после осаждения данных соединений спиртом этиловым 95% соответственно. Результаты исследований по количественному определению основных групп БАВ листьев осины представлены в табл. 2.

Таблица 2

Количественное содержание основных групп биологически активных и сопутствующих веществ в листьях осины

№ серии Содержание ФЛ (в пересчете на гиперозид), % Содержание ФГ (в пересчете на салицин), % Содержание ФК (в пересчете на хлорогеновую кислоту), % Содержание дубильных (легкоокисля-емых) веществ, % Содержание полисахари-дов, %
1 1,19 ±0,05 3,67±0,06 1,50±0,06 2,71±0,12 3,29±0,15
2 2,10 ±0,05 4,40±0,08 2,46±0,09 4,98±0,12 3,53±0,07
3 1,02±0,05 3,79±0,14 1,36±0,06 2,35±0,09 2,68±0,09
4 1,54±0,05 5,64±0,18 2,32±0,07 4,91±0,14 2,48±0,05
5 0,97±0,04 4,28±0,15 1,06±0,05 4,95±0,22 5,52±0,14




Из данных, представленных в табл. 2, видно, что содержание флавоноидов в листьях осины обыкновенной в пересчете на гиперозид в различных сериях сырья варьирует от 0,97±0,04% до 2,10±0,05%; фенологликозидов в пересчете на салицин – от 3,67±0,06% до 5,64±0,18%: фенолокислот в пересчете на хлорогеновую кислоту – от 1,06±0,05% до 2,46±0,09%; дубильных веществ (легкоокисляемых веществ) - от 2,35±0,09% до 4,98±0,12%, полисахаридов – от 2,48±0,05% до 5,52±0,14%.

Зависимость содержания БАВ от фаз вегетации и места произрастания. Учитывая тот факт, что качественный состав БАВ растительного сырья зависит от множества факторов, в том числе от места и времени заготовки, была проведена серия экспериментов по определению содержания флавоноидов и фенологликозидов в листьях осины, заготовленных в различных районах Алтайского края и Новосибирской области. Полученные данные свидетельствуют о том, что нет резких различий в содержании указанных веществ в листьях осины различных районов заготовки. Изучение динамики накопления флавоноидов и фенологликозидов в листьях осины обыкновенной в зависимости от срока заготовки (май – октябрь), позволило установить, что качественный состав исследуемых групп БАВ листьев осины за данный период практически идентичен. Заготовку листьев осины обыкновенной возможно проводить в течение всего летнего периода, так как, несмотря на некоторые колебания в содержании указанных групп фенольных соединений, их содержание в сырье достаточно высоко (флавоноидов от 0,99±0,04% до 1,35±0,06%, фенологликозидов от 4,33±0,09% до 5,57±0,10%).

Вышеприведенные исследования по изучению химического состава гидрофильной фракции листьев осины обыкновенной были использованы для выбора показателей качества и методик анализа при стандартизации изучаемого сырья и составления проекта ФСП «Листья осины обыкновенной». Стандартизацию листьев осины обыкновенной проводили на 5 сериях сырья, согласно ОСТу 91 500.05.001–00 «Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения» по следующим показателям: описание, подлинность, потеря в массе при высушивании (не более 10%), содержание основных биологически активных веществ (флавоноидов – не менее 0,9% и фенологликозидов – не менее 3%), зола общая, зола нерастворимая в хлористоводородной кислоты растворе 10%, допустимые примеси, микробиологическая чистота (категория 4Б). Установлено, что предварительный срок годности в условиях естественного хранения для листьев осины обыкновенной составляет 2 года.

3. Разработка технологии, стандартизация, изучение острой токсичности и специфической активности экстракта листьев осины сухого

Разработка технологии. Решение вопроса по разработке ресурсосберегающей технологии экстракта листьев осины сухого было начато с выбора оптимального экстрагента, которым в результате исследований был выбран спирт этиловый 40%, т.к. он обеспечивает максимальное извлечение экстрактивных веществ и фенолокислот по сравнению с водой, спиртом этиловым 20% и 70%; извлекает большее количество флавоноидов по сравнению с водой и спиртом этиловым 20%, одинаковое количество флавоноидов со спиртом этиловым 70%, и по сравнению с последним обеспечивает меньший расход ценного экстрагента.

В качестве параметров сравнительной характеристики процесса экстрагирования фенольных соединений из листьев осины были применены время наступления равновесного состояния в системе «сырье-экстрагент» и коэффициент вымывания. Кроме того, были определены основные технологические свойства и параметры процесса (насыпная масса, коэффициент поглощения сырьем экстрагента, ёмкость диффузора и соотношение «сырье: экстрагент») (табл. 3).

Таблица 3

Технологические свойства сырья и параметры технологического процесса

Параметр Измельченность сырья, мм
5-10 10-15 15-20
1. Время наступления равновесного состояния, час
1.1. по флавоноидам 10 22 22
1.2. по фенологликозидам 12 22 более 24
2. Коэффициент вымывания
2.1. по флавоноидам 0,6 0,32 0,23
2.2. по фенологликозидам 0,25 0,16 0,10
3. Скорость свободного слива извлечений, мл/сек 1,04 1,02 0,98
4. Насыпная масса, г/см3 0,101 0,068 0,053
5.Коэффициент поглощения сырьем экстрагента (Кп), см3/ г 1,9 - -
6. Ёмкость диффузора см3 (на 100 г листьев осины) 1390 - -
7. Соотношение «сырье: экстрагент» 1:4 - -


Pages:     | 1 || 3 | 4 |
 

Похожие работы:










 
© 2013 www.dislib.ru - «Авторефераты диссертаций - бесплатно»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.