авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ РОССИЙСКАЯ БИБЛИОТЕКА - WWW.DISLIB.RU

АВТОРЕФЕРАТЫ, ДИССЕРТАЦИИ, МОНОГРАФИИ, НАУЧНЫЕ СТАТЬИ, КНИГИ

 
<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:   || 2 | 3 |

Методы исследования морфина и трамадола в судебно-химическом анализе

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Заикин Кирилл Сергеевич

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МОРФИНА И ТРАМАДОЛА В СУДЕБНО-ХИМИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ

14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

А в т о р е ф е р а т

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Москва - 2010

Работа выполнена в ГОУ ВПО Московская Медицинская Академия

имени И.М.Сеченова

Научные руководители:

доктор фармацевтических наук, профессор, академик РАМН

доктор фармацевтических наук, профессор

Арзамасцев Александр Павлович

Раменская Галина Владиславовна

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук, Белобородов Владимир Леонидович

профессор

Кандидат фармацевтических наук Герникова Евгения Петровна

Ведущая организация:

Федеральное Государственное Учреждение « Российский центр судебно-медицинской экспертизы Росздрава »

Защита состоится « 24 » мая 2010 г. в 14.00 часов на заседании Диссер-
тационного Совета Д.208.040.09 при Московской Медицинской Академии имени
И.М.Сеченова по адресу: 119019, Москва, Никитский бульвар, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной Научной Медицинской Биб­лиотеке ММА имени И.М.Сеченова по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, 49.

Автореферат разослан « » 2010 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета,

доктор фармацевтических наук,

профессор Садчикова Наталья Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

В настоящее время препараты из группы агонистов опиоидных рецепторов, такие как морфин и трамадол, широко применяются как лекарственные средства. Их применение с немедицинскими целями, а также применение героина, одним из метаболитов которого является морфин, распространено у людей с наркотической зависимостью [Galichet, 2004; Веселовская, 2002]. Часто эти вещества являются причиной передозировок и летальных исходов [Baselt, 1995; Веселовская, 2000].

По отчётным данным 2009 года Государственного Учреждения Здравоохранения Московской области Бюро Судебно-Медицинской Экспертизы Министерства Здравоохранения Московской Области (ГУЗ МО Бюро СМЭ МЗ МО) второе место по результатам исследований биоматериала от живых лиц занимают наркотические вещества, из них подавляющее количество составляют опиаты (3627 положительных из 12539 случаев). По результатам исследования аутопсийного материала наркотические вещества занимают третье место. Среди наркотических веществ преобладают опиаты (1068 положительных из 8037 случаев).

В судебно-химическом анализе для определения агонистов опиоидных рецепторов применяются: высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) [Matthew H. Slawson, 2007]; газожидкостная хроматография (ГЖХ) [Изотов, 2000]; иммунные методы [Sam Niedbala, 2001]. В настоящее время развитие газовой хроматографии с масс-селективным детектором (ГХ-МС) делает этот метод наиболее предпочтительным и перспективным. Метод обладает высокой селективностью, а требуемый предел количественного определения (0,01 мг/л) может быть достигнут при изменении условий хроматографирования.





В связи с тем, что в отечественной литературе отсутствуют валидированные методики определения морфина и трамадола в крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором, учитывающие последние разработки в этой области, актуальной задачей является разработка метода количественного определения морфина и трамадола, который позволит определять эти вещества в крови на уровне терапевтических концентраций.

Сложность в анализе этих препаратов в крови в рамках химико-токсикологических и судебно-химических исследований обусловлена их низкой дозировкой, низкой терапевтической концентрацией, а также сложной биологической матрицей.

Всё вышеизложенное определило цели и задачи исследования.

Цель исследования.

Разработка высокочувствительной, воспроизводимой методики количественного определения морфина и трамадола в крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором, и апробирование данной методики в практике судебно-химических исследований.

Задачи исследования.

  1. Изучить влияние различных экстрагентов на эффективность экстракции морфина и трамадола.
  2. Изучить влияние реакции среды на выход морфина и трамадола.
  3. Разработать методику извлечения с учётом изученных параметров.
  4. Изучить влияние ферментативного гидролиза на выход морфина и трамадола.
  5. Изучить хроматографические свойства морфина и трамадола, на основе которых подобрать оптимальные условия хроматографирования.
  6. Разработать методику количественного определения морфина и трамадола в крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором.
  7. Провести валидацию метода количественного определения морфина и трамадола.
  8. Апробация разработанной методики в судебно-химическом отделении при проведении химико-токсикологического анализа.

Научная новизна.

Впервые была разработана валидированная методика, позволяющая достоверно определять морфин и трамадол в крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором на уровне предела определения - 0,01 мг/л.

Практическое применение.

По результатам серии экспериментов было показано, что проведение ферментативного гидролиза -глюкуронидазой Helix Pomatia значительно увеличивает выход морфина и трамадола при анализе исследуемых биообъектов. Для создания pH среды может быть рекомендовано использование трис-буфера, так как это позволяет добиться максимального выхода морфина и трамадола и получать наиболее стабильные результаты исследований. Разработанная методика определения морфина и трамадола в крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором позволяют определять данные вещества на уровне предела определения.

Положения, выносимые на защиту.

  1. Хроматографическое поведение морфина и трамадола под влиянием различных факторов (экстрагент, рН среды, ферментативный гидролиз).
  2. Разработанная методика количественного определения морфина и трамадола в крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором.
  3. Апробация данной методики в практике судебно-химического и химико-токсикологического анализа.

Внедрение результатов в практику.

Разработанная методика количественного определения морфина и трамадола в крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором может использоваться при проведении судебно-химического и химико-токсикологического анализа. Данная методика внедрена и применяется в ГУЗ МО Бюро СМЭ МЗ МО при проведении исследований аутопсийной крови и сыворотки крови живых лиц.

Апробация работы.

Апробация работы проведена на научно-практическом заседании кафедры фармацевтической химии с курсом токсикологической химии фармацевтического факультета ММА им. И.М. Сеченова 19 января 2010 года.

Основные теоретические положения и практические результаты работы доложены на XIII конгрессе молодых ученых и специалистов «Наука о человеке» (Томск, 2007 г.), IX итоговой научной студенческой конференции с международным участием «Татьянин день», посвященной 250-летию Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова (Москва 2007г.).

Связь задач исследования с проблемным планом.

Диссертационная работа выполнена в рамках комплексной темы кафедры фармацевтической химии с курсом токсикологической химии фармацевтического факультета ММА им. И.М. Сеченова «Совершенствование контроля качества лекарственных средств (фармацевтические и экологические аспекты)» (№ государственной регистрации 01.2.006 06352).



Публикации.

По результатам диссертационного исследования опубликовано 4 печатные работы, в том числе две статьи в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста и состоит из введения, глав: «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Разработка методики количественного определения морфина и трамадола в крови», выводов и списка литературы из 112 источников (94 из ко­торых зарубежные). Работа иллюстрирована 21 рисунком и 22 таблицами.

Результаты экспериментов обработаны статистически, обобщены в табли­цах, проиллюстрированы рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальная часть исследования проводилась на базе судебно-химического отделения ГУЗ МО Бюро СМЭ МЗ МО (заведующая - Крупина Наталья Анатольевна).

При определении морфина и трамадола

газохроматографическим методом в качестве объекта исследования использовалась кровь или сыворотка крови живых лиц и кровь аутопсийного материала. В Бюро СМЭ объекты поступали по направлениям врачей судебно-медицинских экспертов судебно-медицинских отделений Бюро и врачей лечебно-профилактических учреждений (больницы, наркологические диспансеры).

Пробу отбирали в помещениях, приспособленных для сбора, упаковки, нанесения информации на контейнер. Кровь для проведения постмортальных судебно-химических исследований отбирали из периферических венозных сосудов (бедренной, плечевой вен), так как она свободна от постлетальной диффузии.

Кровь для проведения исследований на состояние опьянения наркотическими средствами отбирали из локтевых вен. Контейнер с кровью в период доставки перед проведением анализа хранили в вертикальном положении при температуре 0 - 7°С в течении 1-7 дней. После проведения исследования образец крови хранили в морозильнике при температуре -18°С.

Образцы крови отбирали в объеме 10 мл.

Для пробоподготовки и хроматографического анализа применялись следующие реактивы: -глюкуронидаза Helix pomatia НР-2 131700 ед./мл; хч: хлористый метилен; аммиак 25% раствор; сульфат натрия безводный; уксуснокислый натрий CH3COONa* 3H2O;трис(гидроксиметил)аминометан;БСТФА+1%ТМХС(бистриметилсилилтрифторацетамид) + 1 % триметилхлорсилана FLUKA; концентрированная уксусная кислота; изо-бутиловый спирт; вода дистиллированная.

Приборы: хроматограф Agilent Technologies 6890 N Network GC System; масс-селективный детектор Agilent Technologies 5973 N Network; инжектор фирмы Agilent Technologies 7683 Series; автосемплер Agilent Technologies 7683; термостат фирмы Binder серии FD (диапазон температур +50С - +3000С); встряхиватель IKA HS501 (300 колеб./мин); минишейкер IKA MS1. Колонка капиллярная Agilent 19091S-101 HP-5MS 0.20мм*12м*0,33мкм.

Условия ГХ-МС анализа.

Сканирование проводили в режиме селективного мониторинга индивидуальных ионов (с 6,0 мин по 6,9 мин: 335, 320, 245,216; с 8,05 по 8,4 мин: 429, 414, 401; с 8,4 по 8,65 мин: 399, 340, 287; с 11,0 по 18,3 мин: 450, 482, 506, 539).

Начальная температура колонки - 700С. Время выдержки при начальной температуре - 1 минута. Подъем температуры в диапазоне 70-2800С - 200С/мин. Время выдержки при 2800С-15 мин. Скорость газа носителя (гелий)-1,0 мл/мин. Температуры инжектора, масс-селективного источника и интерфейса -2800С, 2900С и 1800С соответственно. Режим – без сброса (splitless). Объем вводимой пробы - 1 мкл. Программное обеспечение: ChemStation software (Rev.A.10.01 ).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выбор оптимальных условий жидкость-жидкостной экстракции (ЖЖЭ) морфина и трамадола. Выбор экстрагента.

В качестве экстрагентов для морфина и трамадола при проведении ЖЖЭ из крови были изучены смеси для экстракции опиатов из биожидкостей:

хлористый метилен – изобутанол (9:1);

н-гексан – хлористый метилен – изопропанол (60:40:2).

Для оценки эффективности экстракции морфина и трамадола различными растворителями при проведении ЖЖЭ использовали тестовые контрольные образцы сывороток, содержащие 0,4 мг/л морфина и 0,5 мг/л трамадола. При сравнении результатов серии исследований, полученных методом ГХ-МС было выявлено, что эффективность экстракции в образцах, с использованием смеси хлористый метилен – изобутанол (9:1) приблизительно в 3 раза выше, чем при использовании смеси н-гексан – хлористый метилен – изопропанол (60:40:2). Результаты представлены на рисунках 1 и 2.

 Сравнение результатов-2

Рисунок 1. Сравнение результатов исследований тестовых проб сыворотки с концентрацией морфина 0,4 мг/л с использованием различных экстрагентов (среднее значение 10 измерений).

 Сравнение результатов-3

Рисунок 2. Сравнение результатов исследований тестовых проб сыворотки с концентрацией трамадола 0,5 мг/л с использованием различных экстрагентов (среднее значение 10 измерений).

Выбор реакции среды.

Учитывая литературные данные о pКа морфина и трамадола, для оптимизации процедуры экстракции было изучено использование трис(гидроксиметил)аминометана (трис-буфера) (1М) и концентрированного раствора аммиака (25%). Перед нами стояла задача создания оптимального значения pH среды 8,5 – 9,0 для последующего использования процедуры ЖЖЭ смесью хлористый метилен – изобутанол (9:1).

Наиболее высокие и стабильные результаты для создания необходимого pH были получены при использовании трис-буфера. Результаты представлены на рисунках 3 и 4.

 Сравнение результатов-4

Рисунок 3. Сравнение результатов исследований тестовых проб сыворотки с концентрацией морфина 0,4 мг/л после пробоподготовки с использованием аммиака (25% концентрированный раствор) или трис-буфера для создания pH (среднее значение 10 измерений).

 Сравнение результатов-5

Рисунок 4. Сравнение результатов исследований тестовых проб сыворотки с концентрацией трамадола 0,5 мг/л после пробоподготовки с использованием аммиака (25% концентрированный раствор) или трис-буфера для создания pH (среднее значение 10 измерений).

Выбор внутреннего стандарта.

Количественное определение морфина и трамадола в крови осуществляли методом градуировочного графика с использованием внутреннего стандарта. Для использования в качестве внутреннего стандарта нами был выбран бупренорфин.

Преимуществом использования бупренорфина как внутреннего стандарта являются его хроматографические свойства, условия экстракции и дериватизации, подобные таковым у определяемых веществ, стабильность полученных результатов, и его доступность для закупки на территории РФ. В зарубежных литературных данных в качестве внутреннего стандарта используют дейтерированные аналоги исследуемых веществ. В связи с дороговизной и невозможностью закупки дейтерированных аналогов нами был выбран бупренорфин.

2. Количественное определение морфина и трамадола в крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором.

В таблице 1 представлены хромато-масс-спектрометрические характеристики ТМС производных морфина, трамадола и бупренорфина.

Таблица 1

Хромато-масс-спектрометрические характеристики ТМС производных морфина, трамадола и бупренорфина

Соединение Время удерживания, мин m/z
Базовый (100%)
Морфин 2ТМС 8,1 73 42919 41410 4017 23621
Трамадол ТМС 6,4 58 3354 3201 2253 7317
Бупренорфин ТМС 12,7 450 48230 50617 5394 5549


Pages:   || 2 | 3 |
 

Похожие работы:







 
© 2013 www.dislib.ru - «Авторефераты диссертаций - бесплатно»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.