авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ РОССИЙСКАЯ БИБЛИОТЕКА - WWW.DISLIB.RU

АВТОРЕФЕРАТЫ, ДИССЕРТАЦИИ, МОНОГРАФИИ, НАУЧНЫЕ СТАТЬИ, КНИГИ

 
<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:   || 2 | 3 |

Исследование золпидема в химико-токсикологическом отношении

-- [ Страница 1 ] --


На правах рукописи

ЕГОРОВА ЕЛЕНА ИВАНОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ ЗОЛПИДЕМА В химико-токсикологическом отношении


14.04.02 — фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

Пермь 2011

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук,

профессор Хомов Юрий Александрович

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор Ярыгина Татьяна Ивановна,

ГОУ ВПО «Пермская государственная

фармацевтическая академия Росздрава»

кандидат фармацевтических наук, доцент

Захарова Людмила Андреевна,

Управляющая компания «Медисорб Групп»,

г. Пермь

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Первый Московский

государственный медицинский университет

им. И.М. Сеченова Министерства

здравоохранения и социального развития РФ»

Защита состоится «17» мая 2011 г. в 13 часов на заседании Диссертационного совета Д 208.068.01 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Полевая, д. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пермской государственной фармацевтической академии по адресу: г. Пермь, ул. Крупской, д.46.

Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте ПГФА http://pfa.ru «15» апреля 2011 г.

Автореферат разослан «15» апреля 2011 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 208.068.01,

кандидат фармацевтических наук,

доцент И.А. Липатникова


ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Проблема нарушений сна (инсомния) продолжает сохранять свое медицинское и социальное значение. Расстройства, вызванные инсомнией, лидируют по распространенности и влиянию на жизнедеятельность человека.

Некоторые авторы считают, что нарушениями сна страдает почти половина населения планеты. Поэтому снотворные средства (гипнотики) и способы лечения инсомний являются предметом постоянного внимания специалистов и врачей.

Появление нового третьего поколения снотворных препаратов, в том числе производных имидазопиридина, стало значительным шагом в лечении инсомний. Одним из главных представителей этого класса является золпидем, который широко и эффективно используется в медицинской практике за рубежом, а в последние годы и в России.

Препарат хорошо переносится, но в связи с нежелательными побочными явлениями со стороны центральной нервной системы (спутанность сознания, галлюцинации, эйфория, нарушение координации движений, антероградная амнезия), может быть использован в немедицинских целях. Побочные явления проявляются особенно сильно при превышении доз.



При одновременном применении с препаратами с угнетающим действием на ЦНС (другие снотворнные, седативные, антигистаминные средства, алкоголь) происходит взаимное усиление действия, что является причиной интоксикаций различной степени тяжести. При передозировке и длительном применении вызывает зависимость и привыкание. Известны случаи острых и смертельных отравлений.

В связи с этим золпидем имеет токсикологическое значение. Для своевременной и объективной диагностики интоксикаций, учитывая нехарактерность клинической картины, особое значение приобретают результаты химического анализа.

Критический обзор доступной литературы показал, что фармакологическому и клиническому изучению золпидема посвящена значительная часть литературы, информация же о его химико-токсикологическом анализе недостаточна. Все названное делает актуальным разработку методик выделения золпидема, идентификации и количественного определения его из биологических жидкостей и субстратов для целей клинической лабораторной диагностики и химико-токсикологического анализа при злоупотреблениях и экспертизе отравлений.

Цель и задачи. Целью диссертационной работы является исследование по разработке и оптимизации методик изолирования, обнаружения и количественного определения золпидема для нужд его химико-токсикологического анализа.

Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

  • Теоретически прогнозировать и экспериментально подтвердить оптимальные условия изолирования золпидема и применить полученные данные для разработки методик выделения его из биологических объектов.
  • Предложить эффективные способы очистки золпидема, выделенного из биологических объектов.
  • Провести изучение хроматографического поведения золпидема на различных сорбентах и в различных системах растворителей ВЭТСХ с целью введения в ХТС скрининг.
  • Исследовать возможности идентификации золпидема в извлечениях из биосубстратов с помощью химических и современных инструментальных методов.
  • Разработать чувствительные методики количественного определения золпидема с применением УФ-спектрофотометрии, высокоэффективной жидкостной хроматографии и газовой хроматографии – масс-спектрометрии.
  • Изучить пригодность разработанных методик обнаружения и определения для химико-токсикологического анализа золпидема.

Научная новизна. Впервые разработана научно-обоснованная методология химико-токсикологического анализа биологических объектов при интоксикациях золпидемом.

Теоретически обоснована и экспериментально подтверждена возможность прогнозирования оптимальных условий экстрагирования золпидема в зависимости от рКа, рН среды и природы органического растворителя.

Изучены хроматографические параметры золпидема на пластинках ВЭТСХ, Сорбфил, Merck, Силуфол и разработаны условия его обнаружения при ХТС. Установлено, что золпидем укладывается в условия ХТС скрининга лекарственных соединений, имеющих токсикологическое значение.

Разработаны методики идентификации золпидема на основе реакций окрашивания и методов ВЭТСХ, ВЭЖХ, ГХ/МС, ИК и УФспектроскопии.

Изучены спектральные характеристики золпидема в различных растворителях, разработаны методики его количественного определения на основе УФ-спектрофотометрии, ВЭЖХ, ГХ/МС и приведены параметры валидационной оценки.

Разработаны схемы химико-токсикологического анализа биологических объектов при диагностике интоксикаций золпидемом.

Установлено влияние процессов биодеградации на определение золпидема в моче при различных сроках хранения.

Практическая значимость и внедрение результатов исследования.

Разработанные методики пробоподготовки, изолирования, очистки извлечений, обнаружения и количественного определения золпидема рекомендованы для использования в химико-токсикологических лабораториях для аналитической диагностики отравлений, а также в учебном процессе на кафедрах токсикологической и фармацевтической химии фармацевтических ВУЗов.

По результатам исследований подготовлен проект информационного письма «Химико-токсикологический анализ золпидема в биологических жидкостях».

Методики химико-токсикологического анализа золпидема внедрены в практику работы судебно-химического отделения ГУЗОТ Краевого Бюро судебно-медицинской экспертизы, г. Пермь; СХО Бюро судебно-медицинской экспертизы Минздрава Республики Бурятия, г. Улан-Удэ; СХО ГУ Бюро судебно-медицинской экспертизы Минздрава Республики Марий-Эл, г. Йошкар-Ола; Государственного клинического лечебно-профилактического учреждения «Бюро судебно-медицинской экспертизы», г. Киров; а также в учебный процесс на занятиях интернов-аналитиков на кафедре фармацевтической химии ФДПО и ФЗО и токсикологической химии Пермской государственной фармацевтической академии.

Разработанные методики включены в практику судебно-медицинских и химико-токсикологических лабораторий через постоянно действующие курсы специализации и усовершенствования врачей-лаборантов и врачей судебно-медицинских экспертов в региональном учебно-методическом центре аналитической диагностики наличия наркотических средств, психотропных и других токсических веществ Пермской государственной фармацевтической академии (2006-2009 гг.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ, из них 11 статей, из которых - 2 в изданиях перечня ВАК.

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены с опубликованием на 2-nd Russian - Chinese international scientific conferences on pharmacology (Perm, 26-27 October 2006); на научно-практической конференции «Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)», Ростов-на-Дону, 16-17 октября 2006 г.; на XIV и XV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (апрель 2007, 2008 гг., Москва); на Российской научно-практической конференции, посвященной 70-летию ПГФА «Достижения и перспективы в области создания новых лекарственных средств» (27-28 ноября 2007 г., Пермь); на научно-практической конференции «Фармация XXI века: достижения, проблемы и пути их решения» (25-26 апреля 2008 г., Санкт-Петербург); на Российской научно-практической конференции ПГФА, проводимой в рамках 14-ой международной выставки «Медицина и здоровье» (13-15 ноября 2008 г., Пермь); на Межвузовской научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Фармация в XXI веке: эстафета поколений», посвященной 90-летию СПХФА (23-24 апреля 2009 г., Санкт-Петербург); на X Международном научном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке. Инновационные технологии в биологии и медицине», посвященном 50-летнему юбилею РУДН, Москва, 9-12 декабря 2009 г.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия Росздрава». Номер государственной регистрации 01.9.50 007417. Тема диссертации утверждена на заседании ученого совета протокол №4 от 28.12.2006г.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 167 страницах машинописного текста, содержит 32 таблицы и 26 рисунков. Работа состоит из введения, 5 глав, выводов, списка литературы, включающего 170 источников, из них 82 — на иностранных языках, и приложения.

Во введении обоснована актуальность выбранной темы, определены цели и задачи исследования, показана научная и практическая значимость работы, приведены основные положения, выносимые на защиту.

В первой главе (обзор литературы) представлены общие сведения о золпидеме и способы его анализа.

В главе 2 дано краткое описание объектов и методов исследования.

В 3 главе представлены способы обнаружения и определения золпидема на основе методов ВЭЖХ, вариантов НФ- и ОФ- ХТС, ИК-, УФ-спектроскопии, ГХ, ГХ/МС.

4 глава посвящена изолированию, обнаружению и определению золпидема в трупном материале.

В 5 главе показана применимость разработанных методик для анализа биологических жидкостей, в том числе образцов реальной мочи (после принятия терапевтических доз золпидема) методами ХТС, УФ-спектроскопии, ВЭЖХ и ГХ/МС. Представлены параметры валидационной оценки методик определения. Проведено исследование по изучению влияния процессов биодеградации на определение золпидема в моче при различных сроках и условиях хранения проб. Составлена схема химико-токсикологического анализа золпидема в биологических жидкостях.


Положения, выносимые на защиту:

1. Теоретическое обоснование и экспериментальное подтверждение оптимальных условий изолирования золпидема из биологических объектов в зависимости от показателя ионизации, рН среды и природы органического растворителя.

2. Результаты экспериментальных исследований по разработке реакций окрашивания, ВЭТСХ, ВЭЖХ, УФ-спектроскопии и ГХ/МС. УФ-спектрофотометрическая, ВЭЖХ и ГХ/МС методики количественного определения золпидема, разработанные применительно к анализу биологических сред.





3. Данные по выяснению влияния процессов биодеградации на определение золпидема в моче при различных сроках хранения.

4. Схема и общий методологический подход к химико-токсикологическому исследованию биологических субстратов при интоксикациях золпидемом.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ


  1. Способы обнаружения и количественного определения золпидема

При исследовании избрано направление комплексного использования современных физико-химических методов в сочетании с традиционными химическими реакциями с целью выявления наиболее чувствительных и специфичных к задачам химико-токсикологического анализа золпидема.

МКС и реакции окрашивания

Для обнаружения золпидема было изучено отношение его к 20 осадительным реактивам. Со многими (12 из 20) из исследованных реактивов золпидем дает аморфные осадки. Наиболее чувствительными являются реакции с реактивами Драгендорфа (0,57 мкг вещества в пробе) и золотохлористоводородной кислотой (0,50 мкг). Осадков с кристаллическим строением не наблюдалось ни с одним из примененных реактивов.

Далее изучалась возможность применения для обнаружения золпидема реакций окрашивания. Исследовано отношение к 10 реактивам (концентрированные азотная, серная, хлористоводородная кислоты, реактивы Марки, Фреде, Манделина, Эрдмана и др.).

Наиболее чувствительной является реакции с реактивом Марки, (наблюдается красно-оранжевое окрашивание, открываемый минимум – 13 мкг). Реакция была использована в дальнейшем для обнаружения зон локализации золпидема при ХТС. Предел обнаружения золпидема предлагаемой реакцией в хлороформных извлечениях, полученных при изолировании из биологического материала, составляет в моче - 0,22 мг, в печени - 0,30 мг.


Хроматография в тонком слое сорбента

Далее исследована возможность доказательства золпидема методом хроматографии в тонком слое сорбента на пластинках ВЭТСХ, Сорбфил, Силуфол, Merck в нормально-фазном варианте и обращено-фазном варианте на пластинках плазмахром с привитой фазой С3 в индивидуальных растворителях и различных системах комбинированных растворителей, применяемых при ХТА лекарственных и наркотических веществ.

Для детектирования зон локализации золпидема на хроматограмме использовали:

- визуальное наблюдение пластинки в фильтрованном УФ-свете при 254 и 365 нм. При 254 нм (поглощение) наблюдали темно-фиолетовые пятна (предел обнаружения - 0,30 мкг); при 365 нм (свечение) наблюдали пятна, проявляющиеся в виде сиреневой флюоресценции (предел обнаружения - 0,18 мкг);

- обработку реактивом общегруппового назначения - реактивом Драгендорфа по Молдаверу (коричневато-оранжевые пятна, предел обнаружения - 0,35 мкг);

- обработку наиболее специфичным реагентом - реактивом Марки (капельно, наблюдается красно-оранжевое окрашивание, предел обнаружения - 7,0 мкг).

Установлено, что в НФ варианте в исследованных 11 индивидуальных растворителях золпидем не обладает достаточной хроматографической подвижностью, оставаясь в основном вблизи стартовой линии.

При исследовании в комбинированных системах растворителей хроматографическая подвижность золпидема на пластинках ВЭТСХ проявляется в интервале Rf от 0,38 до 0,77 при значении 0,64 в общей универсальной скрининговой системе толуол – ацетон – этанол – 25% раствор аммиака 45:45:7,5:2,5 и скрининговой для азотсодержащих соединений основного характера системе диоксан – хлороформ – ацетон – 25% раствор аммиака 47,5:45:5:2,5 (Rf 0,67), которые были избраны нами в качестве базовых для ХТА золпидема в биологических объектах.

Системы хлороформ - 25% раствор аммиака 25:15 и этилацетат-метанол - 25% раствор аммиака 17:2:1 можно считать оптимальными (Rf 0,54 и 0,38 соответственно) для золпидема и могут быть использованы при направленном анализе в качестве подтверждающих.

В обращенно-фазном варианте использовали водно-спиртовые смеси. Детектирование золпидема проводили теми же способами, что и в нормально-фазном варианте. В общей системе растворителей этанол – вода – 25% раствор аммиака 6:5,5:0,5 Rf золпидема 0,56. При подтверждающем исследовании в частных системах, отличающихся соотношением полярных компонентов, величина Rf золпидема колеблется от 0,39 до 0,69. Из частных систем при ОФ наиболее оптимальна для золпидема система этанол – вода – 25% раствор аммиака 8:1:0,5 (Rf 0,61).

Четкие пятна и аналогичные значения Rf наблюдались в обоих вариантах на каждом виде сорбента как в зоне метчика, так и в зонах хроматографирования исследуемых извлечений.





Исследование золпидема методом ГХ/МС


Исследование золпидема методом газовой хроматографии масс-спектрометрии проведено на газовом хроматографе, оборудованном кварцевой капиллярной колонкой с неполярной неподвижной фазой. Для обнаружения использован масс-селективный детектор (МСД).

Условия хроматографического разделения: хроматограф Agilent 6850; газохроматографическая колонка капиллярная НР-5МS с внутренним диаметром 0,25 мм, длиной 30 м; МСД Agilent 5973N. Газноситель гелий. Скорость потока газа-носителя 1,5 мл/мин. Температура инжектора и интерфейса 250°С и 280°С соответственно. Температура колонки – градиент 70°С (2 мин) — 280°С, скорость программирования 20°С в минуту. Ввод пробы ручной, без деления потока газа-носителя. Объем пробы 1 мкл в спирте этиловом при концентрации в растворе 100 нг/мл. МСД работает в режиме электронного удара при 70 эВ.

Получена хроматограмма (время удерживания золпидема 9,65 мин), проведена регистрация масс-спектров в режиме полного сканирования от 45 до 450 аем. Данные представлены на рисунках 1,2. Характеристические ионы при выделении фрагментограммы, со временем удерживания 9,65 мин — 235, 307, 219, 92 m/z (масс/заряд). Данные приведены в порядке уменьшения m/z. При сравнении с масс-спектрами библиотек совпадение времени удерживания и масс-спектра составляет 98%.

Рисунок 1 - Хроматограмма золпидема ГХ/МС

Рисунок 2 – Масс - спектр золпидема

Количественное ГХ/МС определение проводили в тех же условиях, применяя метод внутреннего стандарта (метиловый эфир налидиксовой кислоты).

Режим регистрации — селективный ионный мониторинг по ионам m/z 235, 307, 219 (золпидем) и 188, 215, 246 (внутренний стандарт). Калибровочный график был получен, исходя из соотношений площадей пиков наиболее интенсивных ионных фрагментов, т.е. ионов с величинами m/z 235 (золпидем) и 188 (внутренний стандарт). График линеен в интервале концентраций 0,1–10 мг/л. Предел обнаружения — 10 нг/мл. Предел количественного определения — 25 нг/мл.

Метод ГХ/МС был использован для качественного и количественного определения золпидема в моче.


УФ-спектрофотометрия



Pages:   || 2 | 3 |
 

Похожие работы:










 
© 2013 www.dislib.ru - «Авторефераты диссертаций - бесплатно»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.