авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ РОССИЙСКАЯ БИБЛИОТЕКА - WWW.DISLIB.RU

АВТОРЕФЕРАТЫ, ДИССЕРТАЦИИ, МОНОГРАФИИ, НАУЧНЫЕ СТАТЬИ, КНИГИ

 
<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:   || 2 | 3 |

Биотехнологические аспекты производства препаратов сальмонеллезного бактериофага

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

ШИТОВА ОЛЬГА ИВАНОВНА

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРОИЗВОДСТВА

ПРЕПАРАТОВ САЛЬМОНЕЛЛЕЗНОГО БАКТЕРИОФАГА


14.04.01 – технология получения лекарств

АВТОРЕФЕРАТ


диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

Пермь – 2013

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель:
доктор медицинских наук, профессор Казьянин Александр Викторович
Научный консультант: доктор медицинских наук Захарова Юлия Александровна
Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, доцент Блинова Ольга Алексеевна
доктор медицинских наук, профессор Маслов Юрий Николаевич
Ведущая организация:
ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Минздрава России

Защита диссертации состоится «___» апреля 2013 года в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 208.068.01. при ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава Российской Федерации по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Полевая, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава Российской Федерации по адресу: 614070, г. Пермь, ул. Крупской, 46.

Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте Министерства образования и науки Российской Федерации http://www.mon.gov.ru «__» ______ 2013 г. и на сайте ГБОУ ВПО ПГФА Минздрава России http://pfa.ru «__» ______2013 г.

Автореферат разослан « » 2013г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат фармацевтических наук Н.В. Слепова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Актуальность проблемы заболеваемости сальмонеллезами, которые в структуре острых кишечных инфекций занимают одно из ведущих мест, определяется их повсеместным распространением, тяжестью течения патологического процесса, возможностью неблагоприятных исходов, длительностью бактерионосительства и значимостью социально-экономического ущерба. Эпидемическая ситуация по сальмонеллезам в мире продолжает оставаться неблагополучной. В последние годы наблюдается тенденция роста заболеваемости сальмонеллезами и в России. Ее уровень в 2011 г. составил 36,13 на 100 тыс. населения [О.В. Гурьева, 2010; Л.С. Удавихина, 2009; И.В. Чиркова, 2008]. Устойчивость сальмонелл к антибиотикам, основным средствам этиотропной терапии, появление полирезистентных вариантов возбудителя [В.Г. Акимкин, 2010; Л.Н. Милютина, 2008] ставят задачу поиска новых лекарственных антимикробных средств, созданных на основе современных биотехнологий.





Одним из направлений в решении этой сложной проблемы является использование лечебно-профилактических препаратов бактериофагов, обеспечивающих специфическое литическое действие на возбудителя и не оказывающих побочных токсических и аллергических реакций на организм человека. В условиях роста антибиотикорезистентности микроорганизмов бактериофаги начинают все шире использоваться в клинической практике [О.С. Дарбеева, 2006; И.В. Красильников, 2010; Е.Б. Лазарева, 2003 и др.].

В сфере изготовления препаратов бактериофагов актуальными являются задачи, связанные с усовершенствованием технологического процесса их производства, включая разработку эффективных способов очистки, конструирование поликомпонентных препаратов и создание новых лекарственных форм. В настоящее время при выпуске сальмонеллезных бактериофагов предпочтение отдается жидким препаратам. Однако, кислая среда желудка оказывает инактивирующее действие на бактериофаг при его пероральном приеме. Сохранение исходной активности фага, уменьшение объемов препаратов при их транспортировке и хранении диктует необходимость выпуска таблетированных и капсульных лекарственных форм.

Таким образом, обеспечение высокой литической активности фага и придание препарату качественно новых потребительских свойств, ставят задачу создания новой желудочно-резистентной таблетированной композиции сальмонеллезного бактериофага на основе совершенствования технологии его производства.

Цель настоящего исследования - совершенствование технологии производства жидкого очищенного препарата сальмонеллезного бактериофага и создание на его основе желудочно-резистентных таблеток без оболочки.

Основные задачи исследования

  1. Создать производственную коллекцию штаммов сальмонелл - продуцентов сальмонеллезного бактериофага с включением в ее состав штаммов серологических вариантов сальмонелл, циркулирующих в Пермском крае.
  2. Усовершенствовать процесс культивирования и разработать способ очистки жидкого сальмонеллезного бактериофага.
  3. Оценить эффективность разработанного способа очистки сальмонеллезного бактериофага, изучить стабильность и антибактериальную активность экспериментально-производственных серий препарата.
  4. Разработать состав и оптимизировать технологию изготовления и параметры таблетирования сальмонеллезного бактериофага.
  5. Провести оценку качества желудочно-резистентных таблеток сальмонеллезного бактериофага без оболочки, изучить их стабильность в процессе хранения.

Научная новизна работы. На основе разработанных принципов периодического обновления качественного и количественного состава культур сальмонелл сформирована производственная коллекция из штаммов - продуцентов сальмонеллезного бактериофага, отражающая этиологическую структуру сальмонеллеза в Пермском крае.

Определены методические приемы по совершенствованию технологии производства сальмонеллезного бактериофага, включая процессы культивирования и очистки препарата от бактериальных клеток и балластных веществ.

Разработаны и признаны изобретением новые технологические подходы для получения таблетированной формы сальмонеллезного бактериофага без оболочки, обеспечивающие его устойчивость к кислому содержимому желудка (Патент РФ на изобретение № 2410084).

Практическая значимость работы. Разработанные эффективные микробиологические и технологические приемы позволяют адаптировать процессы изготовления сальмонеллезного бактериофага к условиям массового производства препарата, расширяющего арсенал отечественных антибактериальных средств.

Сформированная коллекция штаммов-продуцентов сальмонеллезного бактериофага, подвергаемая периодическому обновлению на основе штаммов сальмонелл, циркулирующих на территории Пермского края обеспечивает получение поливалентного препарата Бактериофаг сальмонеллезный групп А,В,С,D,Е.

Способ совместного культивирования штаммов-продуцентов сальмонеллезного бактериофага из разных серологических групп сальмонелл и разработанный способ очистки бактериофага от бактериальных клеток и балластных веществ, позволят получить стабильный очищенный препарат сальмонеллезного бактериофага с высокой литической активностью.

Внедрение результатов исследования. Результаты научной работы отражены в НД: Промышленный регламент № 2057-09 на производство Бактериофага сальмонеллезного групп А,В,С,D,Е жидкого раствора для приема внутрь и местного применения, проект ФСП на Бактериофаг сальмонеллезный групп А,В,С,D,Е таблетки.

Разработан состав и технология производства желудочно-резистентных таблеток сальмонеллезного бактериофага без оболочки. В экспериментально-производственных условиях получены 3 серии желудочно-резистентных таблеток, соответствующих показателям качества нормативной документации.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Всероссийских научно-практических конференциях «Вакцинология - 2006; Вакцинология - 2010. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 2006; Москва, 2010; Международной Российско-китайской конференции по фармакологии «Fundamental pharmacology and pharmacy-clinical practice», Пермь, 2006; Российской научно-практической конференции «Современное состояние и пути оптимизации лекарственного обеспечения населения», Пермь, 2008; Всероссийской научно-практической конференции «Создание и перспективы применения медицинских иммунобиологических препаратов», Пермь, 2008; XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2010.

По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 2 - в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ. Получен Патент РФ на изобретение № 2410084 «Фармацевтическая композиция на основе секстафага (пиобактериофага поливалентного) или бактериофага сальмонеллезного и способ ее получения».

Конкретное участие автора в получении научных результатов. Все приведенные в диссертации данные были получены самим автором или при непосредственном его участии на базе ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава России и филиала ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России «Пермское НПО «Биомед».

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава РФ, номер государственной регистрации 01.9.50 007426.

Объём и структура диссертации. Работа изложена на 137 страницах машинописного текста, содержит 32 таблицы и иллюстрирована 16 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных экспериментальных исследований, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Список цитируемой литературы включает 146 источников, включая 119 отечественных и 27 зарубежных авторов.

Основные положения, выносимые на защиту

  1. Создание производственной коллекции штаммов сальмонелл - продуцентов сальмонеллезных бактериофагов, обеспечивает получение препарата Бактериофаг сальмонеллезный групп А,В,С,D,Е, обладающего высокой специфической литической активностью.
  2. Использование способа совместного культивирования сальмонеллезного бактериофага и бактерий сальмонелл групп А,В,С,D,Е на казеиново-кислотной среде с последующей очисткой фаголизата методом ультрафильтрации позволяет оптимизировать технологию получения и повысить качество препарата.
  3. Оптимизация технологических параметров производства таблетированной формы сальмонеллезного бактериофага (подбор композиции, выбор соотношения вспомогательных веществ и концентрата, метода сушки, формы и массы таблетки, давления прессования) обеспечивает создание желудочно-резистентных таблеток без оболочки, соответствующих требованиям нормативной документации.








ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В первой главе представлен обзор литературы по теме диссертации, включающий изучение эпидемиологических особенностей сальмонеллеза на современном этапе, характеристику биологических свойств сальмонелл. Представлен современный обзор о физиологии и экологии бактериофагов, описаны технологические процессы культивирования, способы очистки, приведены сведения по ассортименту выпускаемых лекарственных форм и технологические приемы их получения.

Во второй главе изложены материалы и методы, использованные при проведении работы.

Основная часть диссертационной работы по созданию желудочно-резистентных таблеток сальмонеллезного бактериофага без оболочки выполнена на базе филиала ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России «Пермское НПО «Биомед». Клиническими базами для проведения бактериологических исследований явились ММУ МСЧ №1 г. Перми, лаборатория «ООО Новые технологи» г. Пермь, ФГБУЗ Пермский клинический центр ФМБА России. В работе использованы эпидемиологические, микробиологические, биотехнологические и статистические методы.

Ретроспективный эпидемиологический анализ заболеваемости сальмонеллезами на территории России и Пермского края за 25 лет (1987-2011гг.) с оценкой многолетней динамики проведен по данным официальной статистики Роспотребнадзора Пермского края. Оценку многолетней динамики заболеваемости сальмонеллезом с определением внутренней тенденции и темпов прироста (снижения) проводили по методике В.И. Речкина (1989г.).

Для формирования производственной коллекции штаммов-продуцентов сальмонеллезного бактериофага использовали штаммы сальмонелл S. paratyphi А, S. рaratyphi В, S. typhimurium, S. heidelberg, S. newport, S. choleraesuis, S. oranienburg, S. infantis, S. dublin, S.enteritidis, S. anatum, S. newlands, выделенные от пациентов с острыми кишечными инфекциями (ОКИ) из стационаров г. Перми и Пермского края (893штамма), а также полученные из ГИСК им. Тарасевича г. Москва (94 штамма). Идентификацию сальмонелл осуществляли по культуральным, тинкториальным, морфологическим, биохимическим, серологическим свойствам с использованием стандартных методик (МУ 4.2.2723-10). Оценку чувствительности штаммов сальмонелл к антибактериальным препаратам (ампициллин, амоксиклав, цефазолин, цефотаксим, гентамицин, доксициклин, ципрофлоксацин, левомицетин, нитрофурантоин) проводили согласно МУК 4.2.1890-04 диско-диффузионным методом.

Чувствительность сальмонелл к бактериофагу определяли путем диффузии фага в питательный агар и по методу Аппельмана. Чувствительность 924 штаммов сальмонелл к клонам вирулентных бактериофагов, лизируемость культур сальмонеллезным фагом определяли по методу Аппельмана в разведениях от 102 до 106. Для повышения литической активности маточного бактериофага проводили его адаптацию путем последовательных селектирующих пассажей на слаболизирующихся штаммах сальмонелл.

С целью получения суточной бульонной культуры 120 производственных штаммов сальмонелл групп А,В,С,D,Е засевали во флаконы со 100 мл казеиново-кислотной среды с последующей инкубацией в термостате в течение 20±4 часов при температуре 36,0±1,0°С.

Раздельное культивирование сальмонелл групп А,В,С,D,Е (стандартный режим) проводили в бутылях вместимостью 5 литров. В каждую емкость, содержащую 2 литра казеиново-кислотной среды, вносили по 100 мл суточной бульонной культуры каждой серологической группы сальмонелл с концентрацией микробных клеток 1х109 КОЕ/мл и добавляли 4,0 мл сальмонеллезного маточного бактериофага. Посевы инкубировали в термостате при температуре 36±10С в течение 18-20 часов.

При совместном культивировании посевной материал сальмонелл групп А,В,С,D,Е и маточный бактериофаг в питательную среду вносили одновременно в одну емкость. Суточную микробную культуру засевали из расчета 75±25 млн. клеток на 1мл среды, маточный бактериофаг - в количестве 0,2% от объема засеваемой среды. Культивирование компонентов вели при температуре 36±10С в течение 18±2 часов до полного лизиса культуры.

Очистку бактериофага от бактериальных клеток, эндотоксина и балластных веществ осуществляли методом мембранного разделения – ультрафильтрации в тангенциальном потоке. Для удаления бактериальных клеток, эндотоксинов и балластных веществ питательной среды первоначально полученый фаголизат сальмонелл в объеме 100,0 л подвергали осветляющей микрофильтрации через мембраны с размером пор 0,6 мкм. Последовательное концентрирование бактериофага в 2, 4 и 10 раз было проведено на ультрафильтрационной установке с волокнами на 100 кДа. В дальнейшем полученные фаголизаты разной степени концентрирования были доведены до первоначального объема (100,0 л) с использованием 0,9% раствора натрия хлорида и подвергались стерилизующей фильтрации через фильтр-капсулы Sartobran P с размером пор 0,2 мкм. В качестве восстанавливающих растворов использовали раствор 0,9% натрия хлорида, 0,9% раствор натрия хлорида с двухзамещенным магния хлоридом, фосфатно-буферный раствор. В роли стабилизирующей добавки применяли 30% раствор желатина.

Эффективность очистки фаголизатов контролировали методом жидкостной хроматографии низкого давления с использованием прибора «LKB» (Швеция). Содержание белка в бактериофаге до и после очистки определяли методом, изложенным в ФС 42-3874-99.

Оценку острой и хронической токсичности жидкого очищенного сальмонеллезного бактериофага проводили в экспериментах на здоровых белых мышах обоего пола массой 19-21 г, в соответствие с требованиями руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ Минздрава РФ [Р.У. Хабриев, 2005]. В экспериментах «острой» токсичности лабораторным животным опытной группы (15 шт.) вводили по 0,5 мл препарата однократно перорально, для изучения «хронической» токсичности – аналогичную дозу per os в течение 20 суток. Животные контрольной группы вместо бактериофага получали эквиобъемное количество 0,9% физиологического раствора. У животных обеих групп проведено макроскопическое исследование внутренних органов (тимус, легкие, сердце, печень, селезенка, почки) с оценкой динамики их массы.

При разработке таблеточной лекарственной композиции сальмонеллезного бактериофага использовали концентрированный в 100 раз жидкий препарат. В качестве вспомогательных веществ для таблетирования были выбраны: кальция глюконат, лактоза, магния стеарат, маннит, метилцеллюлоза марки 16 и 35, микрокристаллическая целлюлоза, натрия альгинат, пектин, полифепан (лигнин гидролизный), сорбит пищевой. Все используемые вспомогательные вещества разрешены к применению в медицине и отвечают требованиям НД.

Оценку качества полученных экспериментально-производственных серий жидкого бактериофага и таблеточной формы (по 3 серии каждой, всего 6 серий) осуществляли по параметрам, предусмотренным требованиями ФСП и ГФ XI в. 1, 2 (определение средней массы таблеток, прочности на истирание, распадаемости) и ГФ XII изд., часть 1 (определение стерильности, микробиологической чистоты, токсичности).

Специфическую активность жидкого бактериофага и его таблеточной формы определяли по методу Аппельмана, на 24 штаммах сальмонелл S. paratyphi А, S. рaratyphi В, S. typhimurium, S. heidelberg, S. newport, S. choleraesuis, S. oranienburg, S. infantis, S. dublin, S.enteritidis, S. anatum, S. newlands, результаты активности выражали в титрах, в баллах и в процентном соотношении к исходной концентрации бактериофага. Концентрацию фаговых частиц в препарате определяли на двухслойном агаре по методу А. Gratia.



Pages:   || 2 | 3 |
 

Похожие работы:







 
© 2013 www.dislib.ru - «Авторефераты диссертаций - бесплатно»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.